GSK3-β – ein Modulator proinflammatorischer Prozesse in primären humanen Colon Lamina Propria Fibroblasten und in Kolonepithelzellen - University of Regensburg Publication Server

URN to cite this document:: urn:nbn:de:bvb:355-epub-284169
DOI to cite this document:: 10.5283/epub.28416

Mayr, Rebecca Anna

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Date of publication of this fulltext: 01 Jul 2013 11:41

Details

Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Open Access Type:	Primary Publication
Date:	1 July 2013
Referee:	Prof. Dr. Florian Obermeier
Date of exam:	11 June 2013
Institutions:	Medicine > Lehrstuhl für Innere Medizin I
Keywords:	GSK3-β, chronisch entzündliche Darmerkrankungen, Entzündung, Morbus Crohn, Colitis Ulcerosa, TLR, Colon Lamina Propria Fibroblasten
Dewey Decimal Classification:	600 Technology > 610 Medical sciences Medicine
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	28416

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Abstract (German)

Abstract (German)

Sowohl die Ätiologie als auch die Pathogenese chronisch entzündlicher Darmerkrankungen sind bisher nicht hinreichend geklärt. Für die Entwicklung neuer Therapiemöglichkeiten dieser chronischen Krankheiten ist jedoch die genaue Kenntnis des chronischen Entzündungszustandes wichtig. Eine fehlregulierte TLR-Signaltransduktion scheint entscheidend für die Aufrechterhaltung der chronischen Entzündungsreaktion zu sein. Welche Signalmoleküle des TLR-Signalwegs unter chronisch entzündeten Bedingungen verändert aktiviert sind, ist bisher jedoch nicht bekannt. GSK3-β wurde kürzlich als ein möglicher Regulator der TLR-abhängigen Signaltransduktion beschrieben. Die Aktivität dieses Enzyms fördert pro-inflammatorische Immunantworten in Blutmonozyten, während anti-inflammatorische Mechanismen blockiert werden. Die Vorarbeiten der Arbeitsgruppe zeigen, dass die Hemmung von GSK3-β mittels LiCl auch überschießende TLR-vermittelte Immunantworten intestinaler Immunzellen auf bakterielle Bestandteile blockiert. Die Rolle von GSK3-β für Entzündungsprozesse in mesenchymalen Zellen ist bisher jedoch noch unklar.
Im Hauptteil dieser Arbeit wurde daher der Effekt der GSK3-β-Blockierung auf die Funktion von Colon Lamina Propria Fibroblasten (CLPF) aus Gewebe von Kontroll- und CED-Patienten untersucht. In zusätzlichen Versuchen wurde der basale Protein- und Phosphorylierungsstatus der GSK3-β in Gesamtgewebe und in bestimmten Zellpopulationen des menschlichen Darms von Kontroll-, MC- und CU-Patienten bestimmt, der Effekt einer GSK3-β-Inhibition hinsichtlich entzündlicher Prozesse in Epithelzellen der HT-29-Epithelzellinie getestet und der GSK3-β-Status sowie die Sekretion bestimmter Zytokine von CLPF nach Kontakt mit Liganden verschiedener TLR-Rezeptoren ermittelt.
Um diese Fragestellung zu klären wurden CLPF aus chirurgischem Material oder aus Biopsien von Kontroll- und CED-Patienten isoliert. Nach Stimulation der CLPF mit TNF oder LPS in An- und Abwesenheit des GSK3-β-Inhibitors LiCl erfolgte die quantitative Bestimmung der IL-6- und IL-8-Konzentrationen in den Überständen mittels ELISA. Die GSK3-β-Phosphorylierung und der Status weiterer zytoplasmatischer Proteine wurde jeweils in Zelllysaten mittels Western Blot bestimmt. Des weiteren wurden aus stimulierten CLPF Zellkernextrakte gewonnen und mittels DNA-Bindungsassays die Aktivität der Transkriptionsfaktoren NF-κB und CREB bestimmt. Dieselben Methoden wurden für die Versuche mit HT-29-Zellen und für die CLPF-Stimulation mit verschiedenen TLR-Liganden angewendet.
Der Proteinstatus und die Phosphorylierung von GSK3-β in primärem Kolon-Gewebe sowie in bestimmten primären Zellpopulationen des menschlichen Darms von Kontroll- und CED-Patienten ergab keine einheitliche Tendenz.
In HT-29-Zellen führte eine Blockierung der GSK3-β mittels LiCl sowohl basal als auch bei Kostimulation mit TNF oder LPS zu einer signifikant erhöhten IL-8-Sekretion. Nach TNF- und LiCl-Kostimulation waren auch die proinflammatorischen Parameter NF-κB, pERK und phospho-p38 erhöht. Die GSK3-β scheint daher in Epithelzellen der HT-29-Zelllinie in grundlegend anderer Weise Einfluss auf die Entzündungsreaktion zu nehmen als in den meisten bisher untersuchten Zellpopulationen.
Der Phosphorylierungsgrad der GSK3-β in primären humanen CLPF wurde durch verschiedenen TLR-Liganden nicht beeinflusst. Trotzdem zeigten sich deutliche Unterschiede hinsichtlich des Ausmaßes der Zytokinsekretion von IL-6 und IL-8.
Die in vitro LiCl-Behandlung von primären humanen CLPF führte zu einer deutlich erhöhten GSK3-β-Phosphorylierung, was auf eine effektive Hemmung des Enzyms hindeutet. Die GSK3-β-Inhibition bewirkte eine Reduktion der basalen und induzierten IL-6- und IL-8-Sekretion von Kontroll- und CED-Zellen, jedoch in unterschiedlicher Effektivität. Den deutlich stärkeren reduktiven Effekt hatte die GSK3-β-Hemmung auf die Sekretion von IL-6. CLPF von MC-Patienten zeigten nach GSK3-β-Inhibition im Vergleich zu Kontroll- und CU-CLPF für alle Stimulationsbedingungen eine sehr viel ausgeprägtere IL-6- und IL-8-Reduktion. Eine Hemmung der GSK3-β scheint also besonders bei MC-CLPF einen protektiven Effekt vor einer übermäßigen Immunreaktion bei Kontakt mit inflammatorischen Stimuli zu bieten. Sowohl die basale als auch die LPS-induzierte NF-κB-Aktivität war in Gegenwart von LiCl vermindert, wodurch der Rückgang der pro-inflammatorischen Zytokinproduktion erklärt werden kann.
Die Hemmung von GSK3-β zeigt somit anti-inflammatorische Effekte auf CLPF aus Kontroll und CED-Gewebe. GSK3-β scheint daher nicht nur ein zentraler Regulator TLR-vermittelter Immunantworten in intestinalen Immunzellen zu sein, sondern auch bestimmte entzündliche Prozesse in mesenchymalen Zellen wie CLPF zu modulieren.

Translation of the abstract (English)

The aetiology as well as the pathogenesis of chronic inflammatory bowel disease is still unknown. For the development of new therapeutic strategies the exact knowledge of the chronic inflammatory mechanisms is very important. A deregulated TLR-dependent signal transduction seems to be decisive for the continuation of chronic inflammation. It is still unknown which signal molecules of the TLR dependent pathway are activated under chronic inflammatory. GSK3-β was recently identified to be a possible regulator of TLR-dependent signal transduction. The active form of this enzyme supports pro-inflammatory immune response in blood monocytes, while anti-inflammatory mechanisms are blocked. The previous work of our workgroup shows that inhibition of GSK3-β by LiCl suppresses excessive immune response against bacterial patterns. The role of GSK3-β for inflammatory processes in mesenchyme cells is still unknown.
In the principle part of this work the effect of GSK3-β inhibition on the function of colon lamina propria fibroblasts (CLPF) out of tissue of control- and IBD-patients has been analysed. In additional experiments the basal protein and phosphorylation status of GSK3-β in common bowel tissue and in different cell populations of the human gut from control patients and patients with CD (Crohn’s disease) and UC (ulcerative colitis) were determined, the effect of GSK3-β inhibition on inflammatory processes in epithelial cells of the HT-29 cell line was tested and the status of GSK3-β as well as the secretion of certain cytokines of CLPF after contact to ligands of certain TLR-receptors was detected.
To solve this problem CLPF from surgical material or from biopsies of control and IBD patients were isolated. After stimulation of the CLPF by TNF and LPS with and without the GSK3-β inhibitor LiCl the IL-6 and IL-8 secretion was quantified by ELISA. The phosphorylation and the status of further cytoplasmic proteins were determined by western blot. Furthermore cell nucleus extracts from stimulated cells were generated. By DNA-binding assays the activity of the transcription factors NF-κB and CREB was detected. The same methods were applied to the experiments with HT-29 cells and to CLPF stimulation with certain TLR-ligands.
The protein status and phosphorylation of GSK3-β in primary colon tissue as well as in different cell populations of the human colon from control and IBD patients showed no consistent tendency.
In HT-29 cells the inhibition of GSK3-β by LiCl led to a significant elevated IL-8 secretion in basal as well as in TNF or LPS induced samples. After TNF and LiCl co-stimulation also the pro-inflammatory parameters NF-κB, pERK and phospho-p38 were increased. Therefore GSK3-β in epithelial cells of the HT-29 cell line seems to influence inflammatory processes in a fundamentally different way than in further examined cell populations.
The level of phosphorylation of GSK3-β in primary human CLPF has not been influenced by different TLR-ligands. Nevertheless obvious differences in the extent of the cytokine secretion of IL6- and IL-8 were observed.
In vitro LiCl treatment of primary human CLPF leads to a clearly enlarged GSK3-β phosphorylation. This points to an effective inhibition of the enzyme. GSK3-β inhibition results in a reduction of basal and induced IL-6 and IL-8 secretion of control and IBD cells. However, this effect was recognised in different levels of efficiency. A greater reductive effect by GSK3-β inhibition was found for the secretion of IL-6. CLPF from CD patients showed a much more distinct IL-6 and IL-8 reduction compared to control and UC cells.
Inhibition of GSK3-β therefore seems to prevent from an excessive immune response especially in CD-CLPF by contact to inflammatory stimuli. Basal as well as LPS-induced NF-κB activity was reduced in presence of LiCl, which can be an explanation of the decreased production of pro-inflammatory cytokines.
Inhibition of GSK3-β shows anti-inflammatory effects on CLPF of control and IBD tissue. GSK3-β seems not only to be a central regulator of TLR-dependent immune responses in intestinal immune cells but also to modulate distinct inflammatory processes in mesenchyme cells like CLPF.

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