Platelet-derived extracellular vesicles in plateletpheresis concentrates as a quality control approach

URN to cite this document:: urn:nbn:de:bvb:355-epub-307964
DOI to cite this document:: 10.5283/epub.30796

Black, Anne

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Date of publication of this fulltext: 02 Oct 2014 15:28

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Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Open Access Type:	Primary Publication
Date:	2 October 2014
Referee:	Prof. Dr. Gerd Schmitz and Prof. Dr. Ernst Holler
Date of exam:	16 September 2014
Institutions:	Medicine > Lehrstuhl für Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin
Keywords:	platelet-derived extracellular vesicles, extracellular vesicles, vesicles, plateletpheresis concentrates
Dewey Decimal Classification:	600 Technology > 610 Medical sciences Medicine
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	30796

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Abstract (English)

Abstract (English)

Platelet-derived extracellular vesicles (PL-EVs) constitute the major part of circulating EVs in blood. They are also present in platelet concentrates (PCs) and may influence the quality of PCs as recent reports implicate significant pro-thrombotic and pro-coagulant activities of PL-EVs. The aim of the present study was to analyze PC-derived PL-EVs and to correlate them with standard quality control (QC) parameters of PCs (e.g. functional capacity of platelets, duration of hemapheresis) and with donor-specific laboratory parameters (e.g. BMI, immature platelet fraction).
PL-EVs, shed from activated and senescent platelets, were analyzed by nanoparticle tracking analysis (NTA) and standard (Navios™) as well as by advanced high sensitivity (Apogee 50M) flow cytometry. A hematology analyzer was applied to the determination of the platelet count and immature platelet fraction (IPF). Functional capacity of platelets (i.e. externalization of CD62P in response to standard TRAP-6 activation) was measured by flow cytometry. Standard QC parameters were recorded during platelet hemapheresis. All in vitro measurements were carried out on day 0 (PC-production, ‘fresh platelets’) and on day 5 (after PC expiry, ‘senescent platelets’). Altogether, n=106 PC-samples were investigated and n=42 (15 of them were irradiated with 25 Gy on day 0) were included in the specific statistical analysis.
The externalization of CD62P, indicative for intact platelet function in PCs, significantly decreased during in vitro platelet senescence and this was inversely correlated with the significant increase of PL-EVs concentration. The size of PL-EVs varied in all PCs investigated, ranging from approx. 70 nm to 550 nm, suggesting that the size spectrum of PL-EVs depends on different vesicle formation mechanisms based on corresponding PLT condition.
Interestingly, in fresh PCs it was found that there is a significant correlation between PL-EVs and PC-production with different hemapheresis instruments, duration of platelet apheresis and the IPF count in peripheral blood of the donor prior to apheresis. In senescent PCs, the BMI of donors inversely correlated with the PL-EV counts.
Accurate measurement of PL-EVs is highly recommended in the regular QC of PCs as a plausibility check of platelet function. Shedding of PL-EVs in PCs depends on shear stress in hemapheresis and diverse pre-analytical conditions, leading to a conclusion that the quality of platelet concentrates is strongly influenced by PL-EVs.

Translation of the abstract (German)

Im zirkulierenden Blut des Menschen stammt der überwiegende Anteil der extrazellulären Vesikel (EVs) von Thrombozyten und Megakaryozyten ab. Die thrombozytären EVs kommen ebenfalls in Apheresekonzentraten, wie beispielsweise Thrombozytapheresekonzentraten (TKs) vor und beeinflussen die Qualität der Blutprodukte auf unterschiedliche, noch nicht umfassend geklärte Weise. Unter anderem haben thrombozytäre EVs erwiesenermaßen pro-thrombotische und pro-koagulatorische Eigenschaften, die damit auch die pharmazeutische Wirkung der Blutprodukte beeinflussen.
Ziel der vorliegenden Studie war, den qualitativen und quantitativen Nachweis von thrombozytären EVs in TKs mit den aktuell standardisierten Parametern der Qualitätskontrolle (QK) zu korrelieren. Standardtests umfassten dabei unter anderem die funktionelle Kapazität von Thrombozyten im TK und die Apheresedauer bei Herstellung der TKs und die damit verbundene Aktivierung der Plättchen durch Scherkräfte. Es wurden ebenfalls Spender-spezifische Laborparameter, wie Glukose, Thrombozytenzahl vor Apherese oder unreife Thrombozytenfraktion, als auch klinisch orientierende Parameter (z.B. Body Mass Index, BMI) auf einen Zusammenhang mit dem Nachweis von thrombozytären EVs hin untersucht.
Thrombozytäre EVs werden von der Membran aktivierter und/ oder alternder Plättchen abgeschnürt. Diese wurden mittels eines Nanoparticle Tracking Analysis (NTA)-Verfahrens, eines Standard Durchflusszytometers (Navios™), als auch mit einem hochauflösenden Durchflusszytometer (Apogee 50M) gemessen. Die Thrombozytenzahl und Fraktion unreifer Thrombozyten wurde mit einem automatisierten Hämatologie-Automaten bestimmt. Die funktionelle Kapazität von Thrombozyten anhand der Expression von P-Selectin (CD62P) nach Aktivierung mit TRAP-6-Reagenz wurde durchflusszytometrisch erfasst. Die übrigen Standard-Parameter für die QK wurden während der Aphereseprozedur ermittelt. Alle in vitro Tests wurden an frischen Thrombozyten am Tag der Herstellung (Tag 0) und mit gealterten Thrombozyten bei sachgerechter Lagerung der Konzentrate nach Ablauf der Haltbarkeit (Tag 5) durchgeführt. Insgesamt wurden 106 TK-Proben untersucht. Von allen Proben wurden 42 TKs, darunter 15 bestrahlte TKs (25 Gy am Tag der Herstellung), in die spezielle Auswertung eingeschlossen.
Die Expression von CD62P als Indikator für intakte, funktionsfähige Thrombozyten, nahm während der in vitro Lagerung der TKs über einen Zeitraum von 5 Tagen signifikant ab. Diese Funktionsabnahme der Plättchen korrelierte signifikant invers mit der Zunahme von thrombozytären EVs pro Thrombozytenzahl. Die Größe der thrombozytären EVs der untersuchten TKs variierte heterogen in einem Bereich von 70 - 550 nm, was darauf schließen lässt, dass verschiedene Mechanismen der Produktion von EVs zu Grunde liegen. Interessanterweise zeigten sich signifikante Unterschiede des EV-Gehaltes in frischen TKs durch den Einsatz unterschiedlicher Apherese-Maschinen, durch die unterschiedliche Apheresedauer und die Fraktion unreifer Thrombozyten aus peripherem Blut der Spender vor der Apherese. In TKs mit gealterten Thrombozyten korrelierte der Anteil thrombozytärer EVs invers mit dem BMI der Spender.
Die Messung des Anteils an thrombozytären EVs in TKs ist als sinnvoller Plausibilitätstests zur Funktionalität der Thrombozyten in der regulären QK zu empfehlen. Die Vesikulation von thrombozytären EVs in TKs ist abhängig vom Scherstress der Thrombozyten während der Herstellung und ist abhängig von verschiedenen anderen präanalytischen und Spender-spezifischen Faktoren. Demzufolge beeinflusst der Anteil an thrombozytären EVs die Qualität von Thrombozytapheresekonzentraten.

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