| License: Publishing license for publications excluding print on demand (12MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-308062
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.30806
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 1 December 2014 |
| Referee: | Prof. Dr. Jörg Heilmann |
| Date of exam: | 25 September 2014 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical Biology (Prof. Heilmann) |
| Keywords: | Matricin, Chamazulen, ICAM-1, NF-kB |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 30806 |
Abstract (German)
E.1 Phytochemische und pharmakologische Untersuchungen von Proazulenen aus Kamille und Schafgarbe Im Teil B dieser Arbeit konnte eine Isolierung des Proazulens Matricin aus der Kamille (Matricaria recutita L.) durch rein chromatographische Methoden entwickelt werden. Mit Hilfe von drei Flash-Chromatographieschritten an Kieselgel, Aluminiumoxid und RP-18-Kieselgel konnte Matricin einer Reinheit ...
Abstract (German)
E.1 Phytochemische und pharmakologische Untersuchungen von Proazulenen aus Kamille und Schafgarbe
Im Teil B dieser Arbeit konnte eine Isolierung des Proazulens Matricin aus der Kamille (Matricaria recutita L.) durch rein chromatographische Methoden entwickelt werden. Mit Hilfe von drei Flash-Chromatographieschritten an Kieselgel, Aluminiumoxid und RP-18-Kieselgel konnte Matricin einer Reinheit von (98,6%, HPLC) und einer Ausbeute von 0,016% isoliert werden. Außerdem wurde eine Methode zur Isolierung des Matricinderivats 8-Desacetyl-8-angeloyl-4-epi-matricin aus Schafgarbenkraut (Achillea millefolium agg.) etabliert.
Aufgrund der relativ widersprüchlichen Datenlage bezüglich der Pharmakologie des Matricins und seines Abbauprodukts, dem Chamazulen, wurden beide Substanzen in vitro auf potentiell anti-inflammatorische Aktivität untersucht. Dazu wurden zellbasierte Testsysteme mit humanen Endothelzellen (HMEC-1) und murinen Makrophagen (RAW 264.7) benutzt. Außerdem wurde ein zellfreier Assay zur NO-Radikalfängereigenschaft angewandt (SNP-Assay). Matricin zeigte eine dosisabhängige Inhibierung der TNF-α- und LPS-stimmulierten ICAM-1-Expression (intercellular adhesion molecule) bei HMEC-1 im nicht-toxischen Konzentrationsbereich, wohingegen sich Chamazulen als inaktiv erwies. Die Expression des Adhäsionsmoleküls ICAM-1 steht in engem Zusammenhang mit dem Entzündungsgeschehen im Gewebe und wird u.a. über den NF-κB-Weg aktiviert. Mit Hilfe von immunfluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen von mit TNF-α-stimmulierten humanen Endothelzellen konnte eine Translokationshemmung des Transkriptionsfaktors NF-κB vom Zytoplasma in den Zellkern durch Matricin nachgewiesen werden. Chamazulen hingegen hemmte die Translokation nicht. Auch in einem Reportergen-Assay konnte die NF-κB-Promotoraktivität dosisabhängig durch Matricin vermindert werden.
Ein weiteres wichtiges Ereignis im Entzündungsgeschehen stellt die Synthese von Stickstoffmonoxid (NO)-Radikalen durch die induzierbare NO-Synthase (iNOS) von Makrophagen dar. Als Reaktion auf Infektionen dient NO einerseits der unmittelbaren Bekämpfung pathogener, mikrobieller Organismen, bei chronischer Überproduktion hingegen verursacht es chronisch entzündliche Gewebeerkrankungen. NO wird in Lösung in Nitrit umgewandelt, welches akkumuliert und mittels Griess-Reagenz nachgewiesen werden kann. Matricin und Chamazulen konnten bei 24-stündiger Applikation dosisabhängig die Nitrit-Akkumulation im Zellüberstand von LPS-stimmulierten RAW 264.7-Zellen (Griess-Assay) reduzieren, wobei Matricin (IC50 = 20,9 µM) effektiver war als Chamazulen (IC50 = 59,3 µM). Beide Substanzen waren in den untersuchten Konzentrationen nicht toxisch für RAW 264.7 Zellen. Im zellfreien SNP-Assay, in dem NO durch einen metallorganischen NO-Donor generiert wird, zeigte sich, dass Chamazulen die Nitrit-Konzentration senkte, während Matricin keinen Einfluss hatte. In einem modifizierten Griess-Assay wurde der zeitliche Einfluss von Matricin und Chamazulen auf die Nitrit-Konzentration im Zellüberstand von LPS-stimmulierten RAW 264.7-Zellen gemessen. Nach 24 h Inkubation zeigte sich das analoge Ergebnis zum klassischen Griess-Assay. Nach nur 1 h Inkubation zeigte das Matricin keinerlei Einfluss, wohingegen das Chamazulen die Nitrit-Konzentration bereits zu senken vermochte. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass die entzündungshemmende Aktivität des Matricins schon prä-transkriptionell evtl. über eine Translokationshemmung von NF-κB und die dadurch bedingte Verminderung der Menge inflammatorischer Proteine wie z.B. ICAM-1 oder iNOS vermittelt wird, während das Chamazulen lediglich als Radikalfänger fungiert und wenig Einfluss auf die Signaltransduktion der Zelle nimmt.
In einem zweiten Projekt des Teils B dieser Arbeit erwiesen sich sowohl die proazulenreichen Fraktionen eines Schafgarbenblütenextrakts (DCM) als auch der Extrakt selbst als äußerst potent bezüglich ihrer anti-inflammatorischen Aktivität, sowohl im ICAM-1-Assay als auch im Griess-Assay. So verminderte der Extrakt die ICAM-1-Expression bei HMEC-1 bei einer Konzentration von 12,5 µg/ml auf 21,1%. Im Griess-Assay senkte der Extrakt in einer Konzentration von 5 µg/ml die Nitrit-Konzentration auf 38,7% im Vergleich zur Kontrolle. Die proazulenreiche Fraktion V zeigte sich bei einer Konzentration von 5 µg/ml und einer Verminderung der Nitrit-Konzentration auf unter 30% noch aktiver als der Extrakt selbst. Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass die Proazulene aus der Schafgarbe einen nicht unerheblichen Anteil an der entzündungshemmenden Wirkung dieser Pflanze haben.
E.2 Chemoökologische Untersuchungen zu Arnica montana L.
Die chemoökologische Untersuchung von 79 Proben von Arnica montana L. aus Maramureş (Rumänien) ergab keine signifikanten Zusammenhänge zwischen Umweltparametern und dem Gehalt bzw. der Zusammensetzung der Sesquiterpenlactone (SL) vom Helenalin- und Dihydrohelenalintyp. Die Variabilität der Inhaltsstoffmuster der Arnikaindividuen war auch unter den ähnlichen Umweltbedingungen eines Standorts sehr hoch, hingegen bei untersuchten Arnikaklonen deutlich geringer. In Stressexperimenten an Arnika-Klonen konnte außerdem keine Veränderung der SL-Muster induziert werden. Diese Ergebnisse weisen auf einen geringen Einfluss von Umweltfaktoren und einen größeren Einfluss der Erbanlagen auf die Biosynthese der SL bei Arnika hin.
Das Verhältnis von Helenalin- zu Dihydrohelenalinestern der rumänischen Arnikaproben lag zwischen dem des helenalinreichen mitteleuropäischen und dem des spanischen Chemotyps. Der durchschnittliche Gesamtgehalt an SL lag mit 0,28% unter den Mindestanforderungen des Europäischen Arzneibuchs von 0,40%.
Translation of the abstract (English)
F.1 Phytochemical and pharmacological investigations of Chamomile and Yarrow In the first part B of this study a straight isolation procedure of the proazulene matricin from chamomille (Matricaria recutita L.) was established. Using 3 chromatographic steps with different stationary phases (silica gel, alumina and RP-18-silica gel), matricin was obtained in a yield of 0.016% exhibiting a purity of ...
Translation of the abstract (English)
F.1 Phytochemical and pharmacological investigations of Chamomile and Yarrow
In the first part B of this study a straight isolation procedure of the proazulene matricin from chamomille (Matricaria recutita L.) was established. Using 3 chromatographic steps with different stationary phases (silica gel, alumina and RP-18-silica gel), matricin was obtained in a yield of 0.016% exhibiting a purity of 98.6% (HPLC). Furthermore, a method was developed to isolate the matricin derivative 8-desacetyl-8-angeloyl-4-epi-matricin from Yarrow herb (Achillea millefolium agg.).
Due to contradictory data concerning the pharmacology of matricin and its degradation product chamazulene, both substances were tested in terms of their anti-inflammatory potential in vitro. Therefore, cell-based assays with human microvascular endothelic cells (HMEC-1) and murine macrophages (RAW 264.7) and a cell-free NO-scavenger-assay (SNP-assay) were used. Matricin inhibited TNF-α and LPS induced ICAM-1 expression (intercellular adhesion molecule 1) in HMEC-1 dose-dependently, whereas chamazulene was inactive. Both substances were tested in non-cytotoxic concentrations. ICAM-1 expression is associated with inflammatory processes in tissues and is, amongst others, activated via the NF-κB-pathway. Immunfluorescence microscopy of TNF-α stimulated HMEC-1 revealed an inhibitory effect of matricin on the translocation of NF-κB from the cytoplasm into the nucleus. Chamazulene did not affect the NF-κB translocation. Furthermore, in a reporter gene assay matricin down-regulated the NF-κB-promotor activity in a dose-dependent manner.
Another important element of inflammation is the production of nitric oxide radicals (NO) via inducible NO-synthase (iNOS) by macrophages. On the one hand, NO helps to control pathogenic microbes, as a reaction on acute infection. On the other hand, chronical over production of NO can cause tissue-damage. Dissolved NO is converted into nitrite which accumulates in the supernatant and can be analyzed using the griess-ragent. Matricin and chamazulene reduced the nitrite concentration in the supernatant of LPS stimulated RAW 264.7-cells (Griess-assay) after 24 h incubation in a dose-dependant manner. Matricin was more active (IC50 = 20.9 µM) compared to chamazulene (IC50 = 59.3 µM). Both substances proved to be non-cytotoxic in the tested concentrations. The cell-free SNP-assay indicated that chamazulene lowered nitrite concentration in contrast to matricin The influence of incubation time of matricin and chamazulene on LPS-stimulated RAW-cells was examined by a modified Griess-assay. After 24 h the results were equal to the conventional Griess-assay. When incubating cells just 1 h, matricin showed no influence on the nitrite-concentration whereas chamazulene reduced nitrite accumulation. Therefore, it can be assumed that anti-inflammatory activity of matricin is mediated pre-transcriptionally maybe via inhibition of NF-κB translocation and the associated decrease of inflammatory protein-levels such as ICAM-1 and iNOS, whereas chamazulene could act as a NO-scavenger with less or no influence on the signal transduction of the cell.
In a second project of part B of this study, the high in vitro anti-inflammatory activity of a yarrow flowerhead extract (DCM) and its proazulene-rich fractions in the ICAM-1-assay and Griess-assay was shown. The yarrow crude extract, for instance, reduced ICAM-1 expression in HMEC-1 to 21.1% at a concentration of 12.5 µg/ml and decreased the nitrite accumulation in the Griess-assay down to 38.7% in a concentration of 5 µg/ml compared to the control group. The proazulene-rich fraction V was even more active than the extract and reduced the nitrite accumulation below 30% in a concentration of 5 µg/ml. Thus it can be presumed that proazulenes play a significant role in the anti-inflammatory effects of A. millefolium.
F.2 Chemo-ecological investigations of Arnica montana L.
No significant correlation between helenalin- and dihydrohelenalintype sesquiterpene lactone (SL) content and ecological parameters was observed during a chemo-ecological investigation of 79 samples of Arnica montana L. in Maramureş (Romania). Variability of the SL-composition between individuals was quite high despite high similarity of environmental conditions on site. In contrast, Arnica-clones exhibited less variability. In addition, changes of SL-pattern were not inducible by stress-experiments with Arnica-clones. These results are suggestive of a higher genetic influence on SL-composition of Arnica plants compared to environmental influences. The ratio of helenaline- and dihydrohelenaline esters of the Romanian samples was in between the ration of the middle-european and the Spanish chemotype. The mean SL-content of 0.28% was below the minimum standard of 0.40% of the European Pharmacopoeia.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 00:43
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