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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-313576
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.31357
Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
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Open Access Art: | Primärpublikation |
Datum: | 4 August 2015 |
Begutachter (Erstgutachter): | PD Dr. Ulrike Strauch |
Tag der Prüfung: | 20 Februar 2015 |
Institutionen: | Medizin > Lehrstuhl für Innere Medizin I |
Stichwörter / Keywords: | intestinale epitheliale Wundheilung, Kaliumkanäle, epidermaler Wachstumsfaktor |
Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin |
Status: | Veröffentlicht |
Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
Dokumenten-ID: | 31357 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Die Pathogenese von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED) ist nach wie vor nur unzureichend verstanden. Als gesichert gilt jedoch, dass an ihrer Entstehung und Unterhaltung eine genetische Prädisposition verbunden mit einer Störung der epithelialen Permeabilität des Darmes und einer fehlregulierten Immunantwort auf translozierte – insbesondere bakterielle – Antigene beteiligt sind. ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Die Pathogenese von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED) ist nach wie vor nur unzureichend verstanden. Als gesichert gilt jedoch, dass an ihrer Entstehung und Unterhaltung eine genetische Prädisposition verbunden mit einer Störung der epithelialen Permeabilität des Darmes und einer fehlregulierten Immunantwort auf translozierte – insbesondere bakterielle – Antigene beteiligt sind.
Sowohl primär als auch sekundär können auch kleine, rein epitheliale Wunden zur gestörten epithelialen Barriere bei CED beitragen. Solche Epithelläsionen werden durch einen Restitution genannten Vorgang wieder geschlossen, der vorwiegend durch Migration von am Wundrand liegenden Zellen auf das Wundareal geprägt ist.
Bei der Zellmigration handelt es sich um einen komplexen Prozess, im Laufe dessen sich die migrierende Zelle polarisiert und abwechselnd die Zellfront vorschiebt und den Zellschwanz nachzieht. Zahlreiche Regulationsmechanismen beeinflussen den Ablauf von Restitution bzw. Migration. Unter anderem sind daran auch Kaliumkanäle sowie vom epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor (EGFr) ausgehende Signalkaskaden beteiligt.
Vorrangiges Ziel der vorliegenden Arbeit war daher, in zwei Migrationsassays die Regulation der intestinalen epithelialen Restitution unter nicht entzündlichen sowie entzündlichen Bedingungen durch verschiedene Kaliumkanäle und durch epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) zu untersuchen. Des Weiteren wurde mittels Western Blot (WB)-Experimenten versucht, bestimmte intrazelluläre Signalkaskaden als Vermittler der gefundenen Effekte zu identifizieren. Schließlich wurde aus intestinalen Epithelzellen (IEC) von Patienten mit CED sowie von Kontrollpatienten mRNA isoliert und die Expression des Kaliumkanals KCa3.1 gemessen.
Die intestinale Restitution bzw. Migration wurde anhand der aus der Ratte stammenden, nicht transformierten Zelllinie IEC 18 in scratch assays sowie Boyden-Kammer assays untersucht.
In den scratch assays konnte eine Steigerung der Zellmigration durch Hemmung der kalziumabhängigen Kaliumkanäle KCa3.1 und KCa1.1 sowie eine Reduktion der Migration durch Aktivierung von KCa3.1 gezeigt werden. Die Hemmung anderer Kaliumkanäle zeigte keinen Effekt. Zusätzliche Zugabe von EGF konnte die KCa3.1- und KCa1.1-abhängig gesteigerte Wundheilung nicht weiter steigern.
Entzündliche Bedingungen wurden durch 24-stündige Vorinkubation der Zellen mit IFN-γ simuliert. KCa3.1-Blockade führte unter diesen Umständen zu einer Reduktion der Restitution. Die Zugabe von EGF hob dies jedoch wieder auf und steigerte die KCa3.1-abhängige Migration auf Werte wie sie unter nicht entzündlichen Bedingungen gemessen wurden.
Auch in Boyden Kammer-assays war unter nicht entzündlichen Bedingungen die Zellmigration durch KCa3.1-Hemmung gesteigert, während entzündliche Bedingungen zum gegenteiligen Effekt führten.
Aufgrund dieser Daten ist eine gegensätzliche Regulation der intestinalen epithelialen Restitution unter nicht entzündlichen bzw. entzündlichen Bedingungen wahrscheinlich. Zudem kann eine Beteiligung EGFr-abhängiger Signalwege am Regulationsmechanismus vermutet werden.
Mittels WB wurde die Phosphorylierung von PKB/Akt und ERK bis acht Stunden nach Verwundung in Abhängigkeit von Kaliumkanalmodulatoren und/oder EGF unter nicht entzündlichen und entzündlichen Bedingungen gemessen.
Während die ERK-Phosphorylierung kaum verändert war und die Effekte auf die Restitution nicht erklärt, führte KCa3.1-Inhibition unter nicht entzündlichen, nicht aber unter entzündlichen Bedingungen zu einer nach zwei Stunden signifikant erhöhten Akt-Phosphorylierung. Zusätzliche Zugabe von EGF konnte den Wert unter nicht entzündlichen Bedingungen nicht weiter anheben, jedoch unter entzündlichen Bedingungen die Phosphorylierung signifikant steigern.
Wie durch Gegenüberstellung der Akt-Phosphorylierung nach zwei Stunden mit dem Wachstumsverlauf in den scratch-assays sowie durch statistische Analysen gezeigt werden konnte, besteht bei KCa3.1-Hemmung über alle Konstellationen hinweg eine sehr starke und signifikante Korrelation zwischen der Akt-Phosphorylierung und der Zellmigration in den scratch-assays 60-240 Minuten nach Verwundung. In diesem Zeitraum werden auch die höchsten Wundschlussraten gemessen.
Diese Daten legen nahe, dass tatsächlich EGFr-abhängige Signalwege an der Vermittlung der Effekte von KCa3.1-Inhibition auf die intestinale Zellmigration beteiligt sind und der PI3K-Signalweg mit Akt als zentraler Kinase hierbei eine Schlüsselrolle einnimmt.
Aus OP-Resektaten und endoskopischen Biopsien von Patienten mit CED sowie von Kontrollpatienten mit kolorektalem Karzinom (CRC) oder Sigmadivertikulitis (SD) wurde mRNA isoliert und im TaqMan® die Expression von KCa3.1 sowie Kv7.1 bestimmt.
Sowohl bei Colitis ulcerosa (CU) als auch bei Morbus Crohn (MC) war die Expression von KCa3.1, nicht aber von Kv7.1 gegenüber beiden Kontrollgruppen gesteigert. Wurde für MC nach Proben aus makroskopisch entzündeter und makroskopisch nicht entzündeter Schleimhaut unterschieden, so ließ sich eine vermehrte Expression nur für entzündete Bereiche nachweisen.
Im Hinblick auf die Wundheilung unter entzündlichen Bedingungen könnte dies Ausdruck einer kompensatorischen Mehrexpression des Kanals sein und unterstreicht, dass KCa3.1 und die Regulation der intestinalen Restitution durch diesen Kaliumkanal auch klinisch relevant sein können.
Insgesamt konnte in der vorliegenden Arbeit also eine gegensätzliche Regulation der KCa3.1-abhängigen intestinalen epithelialen Wundheilung unter normalen und entzündlichen Bedingungen gezeigt werden, die vermutlich durch von EGFr ausgehende Signalkaskaden, namentlich PKB/Akt, vermittelt wird. Weitergehende Untersuchungen sind notwendig, um mithilfe dieser Erkenntnisse mögliche therapeutische Anwendungen zu entwickeln.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
The etiopathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD) is still not fully understood. Though, it is commonly recognized that genetic predisposition in association with an impairment of the epithelial permeability of the gut and a dysregulated immune response to translocated – especially bacterial – antigens contribute to their development and sustentation. Both primarily and secondarily, ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
The etiopathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD) is still not fully understood. Though, it is commonly recognized that genetic predisposition in association with an impairment of the epithelial permeability of the gut and a dysregulated immune response to translocated – especially bacterial – antigens contribute to their development and sustentation.
Both primarily and secondarily, small and exclusively epithelial wounds can add to a disrupted epithelial barrier in IBD. Such epithelial lesions heal by a process called restitution, which is predominantly characterized by migration of cells adjacent to the wound edge into the denuded area.
Cell migration is a complex process, in which the migrating cell polarizes and alternately pushes its front ahead and pulls its tail after. A magnitude of regulatory mechanisms influence the course of restitution and migration respectively. Among others, potassium channels and signaling cascades originating from epithelial growth factor receptor (EGFr) are involved.
Thus, primary objective of the present work was to investigate the regulation of intestinal epithelial restitution in two migration assays under baseline and inflammatory conditions by different potassium channels and epidermal growth factor (EGF). Moreover, distinct intracellular signaling pathways were tried to identify as mediators of these effects by Western Blot (WB) analysis. Eventually, mRNA was isolated from intestinal epithelial cells (IEC) of patients suffering from IBD and control patients and the expression of the potassium channel KCa3.1 was determined.
Intestinal restitution and migration was investigated in scratch assays and Boyden chamber assays respectively using the rat non transformed cell line IEC 18.
An increase in wound healing by inhibition of the calcium dependent potassium channels KCa3.1 and KCa1.1 and a decrease in restitution by activation of KCa3.1 could be demonstrated in the scratch assays. Inhibition of other potassium channels showed no effect. Increased wound healing in response to KCa3.1 and KCa1.1-inhibition could not be further enhanced by additional application of EGF.
Inflammatory conditions were mimicked by preincubation of IEC 18 with IFN-γ for 24h. Under these conditions, blockade of KCa3.1 induced a reduction of restitution. Addition of EGF abrogated this effect and increased KCa3.1-dependent migration to levels as under baseline conditions.
In Boyden chamber assays, cell migration under baseline conditions was also enhanced upon inhibition of KCa3.1, while inflammatory conditions resulted in the opposite effect.
Regarding these data, a differential regulation of intestinal epithelial restitution under baseline and inflammatory conditions is probable. Furthermore, an involvement of EGFr-dependent signaling cascades can be assumed.
The phosphorylation of PKB/Akt and ERK was assessed by WB up to eight hours after wounding in presence of different potassium channel modulators and/or EGF under baseline and inflammatory conditions.
While ERK phosphorylation was barely affected and could not explain the effects on restitution, Akt phosphorylation was significantly increased two hours after wounding in response to KCa3.1 inhibition under baseline but not under inflammatory conditions. The addition of EGF could not further increase the level observed under baseline conditions, but could significantly increase phosphorylation under inflammatory conditions.
By juxtaposition of Akt phosphorylation two hours after wounding with the course of wound healing in the scratch assays and by statistical analysis, a very strong and significant correlation between Akt phosphorylation and cell migration 60-240 minutes after wounding could be demonstrated for all constellations involving KCa3.1 inhibition. In the mentioned period, the speed of wound closure was highest in the scratch assays.
These data suggest, that EGFr-dependent signaling pathways are effectively involved in the mediation of the effects of KCa3.1 inhibition on intestinal cell migration and that the PI3K signaling pathway with Akt as its central kinase plays a key role herein.
From surgical specimens and endoscopically obtained biopsies of patients with IBD and control patients with colorectal carcinoma (CRC) or sigma diverticulitis (SD), mRNA was isolated and the expression of KCa3.1 and Kv7.1 was determined by TaqMan®.
Both in ulcerative colitis (UC) and in Crohn's disease (CD) the expression of KCa3.1, but not of Kv7.1 was increased compared to both control control groups. When samples from CD patients were subdivided into samples from macroscopically inflamed and not inflamed mucosa, increased expression could only be demonstrated for tissue from inflamed areas.
In regard of wound healing under inflammatory conditions, this could be a sign of compensatory overexpression and underlines that KCa3.1 and the regulation of intestinal restitution by this potassium channel can be of clinical relevance.
Taken together, the present work shows a differential regulation of KCa3.1 dependent intestinal epithelial wound healing under baseline and inflammatory conditions, probably mediated by EGFr downstream signaling pathways, namely PKB/Akt. Further research is mandatory to translate this finding into a possible therapeutical application.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 00:22