Development of a reliable single-cell aCGH suitable for clinical samples

Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Date:	24 June 2015
Referee:	Prof. Dr. Christoph A. Klein
Date of exam:	20 April 2015
Institutions:	Medicine > Lehrstuhl für experimentelle Medizin und Therapieverfahren
Keywords:	disseminated cancer cells (DCCs), single-cell analysis, comparative genomic hybridization (CGH), array CGH, single-cell aCGH
Dewey Decimal Classification:	500 Science > 570 Life sciences 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	31881

Abstract (English)

Disseminated cancer cells (DCCs) and circulating tumor cells (CTCs) comprise oncological precursors of distant metastases. Detailed analysis of these cells bears the potential of identifying key events regulating systemic cancer progression and the occurrence of therapy resistance. However, given their very low abundance and high level of genetic heterogeneity, comprehensive analysis of CTCs and ...

Abstract (English)

Disseminated cancer cells (DCCs) and circulating tumor cells (CTCs) comprise oncological precursors of distant metastases. Detailed analysis of these cells bears the potential of identifying key events regulating systemic cancer progression and the occurrence of therapy resistance. However, given their very low abundance and high level of genetic heterogeneity, comprehensive analysis of CTCs and DCCS is only possible at the single-cell level, thereby making it technically very challenging. Moreover, methods available thus far for detection of numerical and structural copy number changes in single-cell genomes were limited in their resolution disabling precise mapping of the genomic boundaries of genetic lesions. Therefore, the aim of this thesis was to develop a novel methodology allowing robust and highly accurate detection of copy number changes in single cells. For this a new method was established using a previously developed approach for whole genome amplification (WGA) and high-resolution oligonucleotide aCGH arrays. Analysis of well-established cancer cell lines showed that the new methodology allowed highly reproducible detection and accurate quantification of copy number alterations with a resolution of 0.1 Mb. Importantly, the new method proved to be highly tolerant to negative effects introduced by fixation and staining of DCCs making it particularly well suited for analysis of clinical material. In a proof-of-principle the new approach allowed to detecting clonal changes among DCCs occurring during the course of high-dose chemotherapy treatment and revealed clonal selection of genetically less progressed clones. This shows that the new method is well applicable as a tool for monitoring the clonal genetic evolution of cancer cells during treatment, which may aid detection of therapy resistance clones once they arise.

Translation of the abstract (German)

Es wird angenommen, dass sich die Gründerzellen tödlicher Metastasen unter den disseminierten und zirkulierenden Tumorzellen (Disseminated cancer cells, DCC bzw. circulating tumor cells, CTC) befinden. Detaillierte Analysen dieser Zellen bergen das Potential Schlüsselmechanismen der systemischen Progression von Krebserkrankungen und der Entstehung von Therapieresistenz zu identifizieren. ...

Translation of the abstract (German)

Es wird angenommen, dass sich die Gründerzellen tödlicher Metastasen unter den disseminierten und zirkulierenden Tumorzellen (Disseminated cancer cells, DCC bzw. circulating tumor cells, CTC) befinden. Detaillierte Analysen dieser Zellen bergen das Potential Schlüsselmechanismen der systemischen Progression von Krebserkrankungen und der Entstehung von Therapieresistenz zu identifizieren. Allerdings sind molekulare Analysen von DCC und CTC aufgrund ihrer Seltenheit und einer hohen genetischen Heterogenität nur auf der Basis von Einzelzellanalysen und damit verbunden hohem technologischem Aufwand praktikabel. Die bisher zur Verfügung stehenden Methoden zur Untersuchung numerischer und strukturellen Genomveränderungen in Einzelzellen waren in ihrer Auflösung sehr limitiert und eine akkurate Bestimmung von Bruchpunkten im Genom nicht möglich. Ziel dieser Arbeit war es daher, eine neue Methode zur robusten und hochauflösenden Detektion von Veränderungen der Genomkopienanzahl in einzelnen Zellen zu entwickeln. Hierfür wurde eine bereits in der Arbeitsgruppe entwickelte Strategie zur gesamtgenomischen Amplifikation (whole genome amplification, WGA) der DNA einzelner Zellen, sowie kommerziell erhältliche hochauflösende aCGH microarrays basierend auf einer Oligonukleotid-Technologie, verwendet. Die Analyse gut charakterisierter Krebszelllinien zeigte, dass die entwickelte Technologie eine reproduzierbare Detektion und akkurate Quantifizierung von chromosomalen Veränderungen bis zu einer Größe von 0.1 Mb erlaubt. Wichtig hierbei ist, dass dies auch nach potentiell DNA-schädigenden Effekten durch Fixierung und Färbung von Tumorzellen gilt, was für eine Analyse klinischer Proben essentiell ist. In einer proof-of-principle Studie konnten hier die genomischen Veränderungen von Primärtumor, Metastase und zu verschiedenen Zeitpunkten unter systemischer Therapie isolierten DCC verglichen werden. Hierbei ergaben sich Hinweise auf eine Selektion von genetisch weniger weit fortgeschrittenen DCC Klonen unter Hochdosis-Chemotherapie. Diese Ergebnisse bekräftigen das Anwendungspotential der entwickelten Technologie zum Monitoring der genetischen Evolution von Krebszellen während Progression und systemischer Behandlung. Hierdurch könnte die frühzeitige Erkennung einer entstandenen Therapieresistenz ein Behandlungskonzept von Krebspatienten unterstützen.

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