Novel redox indicators for optical detection of NADH

URN to cite this document:: urn:nbn:de:bvb:355-epub-335997
DOI to cite this document:: 10.5283/epub.33599

Fomin, Maksim

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Date of publication of this fulltext: 02 Jan 2017 07:13

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Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Open Access Type:	Primary Publication
Date:	2 January 2017
Referee:	Prof. Dr. Burkhard König
Date of exam:	14 January 2016
Institutions:	Chemistry and Pharmacy > Institut für Organische Chemie Chemistry and Pharmacy > Institut für Organische Chemie > Lehrstuhl Prof. Dr. Burkhard König
Keywords:	cyanine dye, enzymatic assay, redox indicator, NADH, imaging, multicellular tumor spheroid
Dewey Decimal Classification:	500 Science > 540 Chemistry & allied sciences
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	33599

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Abstract (English)

Abstract (English)

The rapid, sensitive, and selective sensing of nicotinamide adenine dinucleotides NAD(P)H is of significant interest for applications in diagnostic assays, synthesis of chiral compounds and drug discovery. The redox couple NAD(P)+/NAD(P)H plays a crucial role in energy metabolism and has been used as a biomarker to detect altered cancer cell metabolism. Furthermore, NAD(P)H detection is desirable for in vitro analysis of NAD+-dependent enzymes, which is important in the context of high-throughput screening and the development of these enzymes for industrial applications. Moreover, NAD(P)+-dependent glucose dehydrogenase (GDH) has been widely utilized for glucose sensors in point-of-care (POC) testing.
Optical techniques proved to be a powerful tool for quantitation of analytes in biological fluids. Both NADH and NADPH absorb light at 340 nm and have intrinsic fluorescence. Direct NAD(P)H detection does not provide adequate sensitivity for most applications. In this regard, colorimetric and fluorescent indicators are particularly attractive, because they are able to change their absorption spectra to a longer wavelength upon reaction with a target analyte. The key considerations in a search for a tailor made NADH indicator include water solubility, rate of reaction with NADH and sensitivity. Up to now, it still remains a challenge to develop an indicator meeting all these demands.
The aim of this thesis was to discover a small molecule indicator for NADH detection.
Chapter 1 introduces the concepts of test strip development for blood glucose monitoring and gives a brief overview of research activities in this area.
Chapter 2 describes, for the first time, that a colorimetric indicator — directly accepting electrons from an enzymatic reaction — can be utilized for glucose sensing on a dry chemistry test strip. The glucose assay reagent included a quinone-functionalised Ru (II) complex, the artificial cofactor cNAD+ and mutated GDH. An absorbance response was observed at 840 nm in proportion to glucose concentration.
Chapter 3 presents a new optical NADH indicator to analyze intracellular metabolic pathways at the single-cell level. The design is based on an electron deficient heterocycle (active acceptor) conjugated to a polymethine chain of the cyanine dye scaffold. Such compounds are nearly colourless and nonfluorescent. Upon hydride transfer from NADH to the active acceptor moiety, cyanine chromophore is unmasked leading to a sensitive absorbance and fluorescence response.

Translation of the abstract (German)

Ein schneller, empfindlicher und selektiver Nachweis von Nicotinamidadenindinukleotid NAD(P)H ist für Anwendungen im Bereich diagnostischer Assays, der Synthese von chiralen Produkten und der Wirkstoffentwicklung von großem Interesse. Das Redoxpaar NAD(P)+/NAD(P)H spielt eine entscheidende Rolle im Energiestoffwechsel und wurde als Biomarker für die Untersuchung des veränderten Stoffwechsels von Krebszellen verwendet. Darüber hinaus ist die Detektion von NAD(P)H für die in vitro Analyse NAD+-abhängiger Enzyme bedeutend. Dies spielt eine Rolle im Zusammenhang mit Hochdurchsatz-Screening und der Entwicklung solcher Enzyme für industrielle Anwendungen. Außerdem wird die NAD(P)+-abhängige Glukosedehydrogenase (GDH) in Glukosesensoren im Bereich der patientennahen Labordiagnostik intensiv genutzt.
Optische Methoden erwiesen sich als geeignete Werkzeuge für die Quantifizierung von Analyten in biologischen Fluiden. Sowohl NADH als auch NADPH absorbieren Licht bei 340 nm und zeigen intrinsische Fluoreszenz. Ein direkter NAD(P)H Nachweis weist allerdings keine ausreichende Sensitivität für die meisten Anwendungen auf. Deswegen sind kolorimetrische und fluoreszierende Indikatoren teilweise attraktiv, da sich ihr Absorptionsspektrum nach Reaktion mit einem gewünschten Analyten zu längeren Wellenlängen hin verschiebt. Die wichtigsten Überlegungen bei der Suche nach einem maßgeschneiderten NADH Indikator beinhalten dessen Wasserlöslichkeit, die Reaktionsgeschwindigkeit mit NADH und die Sensitivität. Bis zum jetzigen Zeitpunkt stellt die Entwicklung eines solch gewünschten Indikators eine Herausforderung dar.
Das Ziel dieser Arbeit war es einen niedermolekularen Indikator für die NADH-Detektion zu finden.
Kapitel 1 führt das Konzept der Teststreifenentwicklung für die Blutzuckermessung ein und gibt einen kurzen Überblick der Forschungsarbeiten auf diesem Gebiet wieder.
Kapitel 2 zeigt zum allerersten Mal, dass ein kolorimetrischer Indikator, der Elektronen direkt aus einer enzymatischen Reaktion aufnimmt, für die Glukosemessung auf einem trockenen Teststreifen verwendet werden kann. Dazu wurden ein Quinon-funktionalisierter Rutheniumkomplex, der künstliche Kofaktor cNAD+ und eine GDH-Mutante verwendet. Dabei wurde das Absorptionssignal bei 840 nm in Abhängigkeit der Glukosekonzentration bestimmt.
Kapitel 3 zeigt einen neuen optischen NADH Indikator für die Analyse intrazellulärer Stoffwechselwege bei Einzelzelluntersuchungen. Dieser basiert auf einem elektronenarmen Heterozyklus (aktiver Akzeptor), der zu einer Polymethinkette des Cyaninfarbstoffgerüsts konjugiert vorliegt. Solche Verbindungen sind nahezu farblos und nicht fluoreszent. Nach einem Hydridtransfer von NADH auf den aktiven Akzeptorteil des Cyaninfarbstoffs erzielt man eine sensitive Absorption- und Fluoreszenzantwort.

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