Untersuchungen der Expression, Funktion und Struktur archaeeller Membrantransportproteine

URN to cite this document:: urn:nbn:de:bvb:355-epub-337366
DOI to cite this document:: 10.5283/epub.33736

Daxer, Stefanie

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Date of publication of this fulltext: 25 Apr 2017 11:21

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Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Open Access Type:	Primary Publication
Date:	25 April 2017
Referee:	Prof. Dr. Christine Ziegler
Date of exam:	26 April 2016
Institutions:	Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Christine Ziegler
Keywords:	Archaea, Membranproteine
Dewey Decimal Classification:	500 Science > 500 Natural sciences & mathematics
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	33736

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Abstract (German)

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Im Rahmen dieser Arbeit sollte ein effizientes heterologes Expressionssystem für Membranproteine der beiden archaeellen Organismen Ignicoccus hospitalis und Nanoarchaeum equitans identifiziert und etabliert werden. Nach bioinformatischer Analyse wurden dafür zunächst geeignete Kandidaten aus beiden Organismen ausgewählt. Die Expression sollte sowohl in prokaryotischen als auch in eukaryotischen Wirtssystemen getestet werden.
Trotz verschiedener Optimierungsmaßnahmen war es nicht möglich, Membranproteine von I. hospitalis erfolgreich bzw. in hinreichender Qualität in E. coli überzuexprimieren. Auch die beiden hier verwendeten archaeellen Wirte eigneten sich nicht zur heterologen Expression. Ein Wechsel zu eukaryotischen Systemen lieferte unterschiedlichen Erfolg für die Expression des putativen MFS Transporters Iho0391. Während das Protein nur in mangelhafter Qualität in einer Insektenzelllinie rekombinant hergestellt werden konnte, führte die Expression in P. pastoris zu homologem Protein, welches mittels IMAC aufgereinigt und bereits für erste funktionelle Analysen verwendet werden konnte. Diese liefern zusammen mit dem erstellten Homologiemodell erste Hinweise auf eine mögliche ATP Transport Funktion durch Iho0391. Unter Umständen könnte durch das MFS Protein sogar ein Energietransport zu N. equitans vermittelt werden.
Im Genom von I. hospitalis wurden insgesamt acht MFS Transporter identifiziert und ihnen eine mögliche Beteiligung am Energietransport in I. hospitalis selbst bzw. zu seinem Symbionten N. equitans zugesprochen. Um Aufschlüsse über die Funktion von MFS Transportern aus I. hospitalis zu erhalten, wurde parallel versucht, homologe MFS Proteine aus anderen Archaeen heterolog in E. coli zu exprimieren. Die Wahl fiel dabei auf Tko1655 aus T. kodakarensis, ein Homolog zu Iho0800. Der MFS Transporter konnte bereits exprimiert und gereinigt werden, funktionelle Analysen wurden jedoch noch nicht durchgeführt. Das erstellte Homologiemodells deutet aber auf eine eventuelle Beteiligung des Transporters am Aminosäurestoffwechsel hin.
Die Expression des putativen C4-Dicarboxylat Transporters Neq014 aus N. equitans war nach Codonoptimierung problemlos in E. coli möglich. Auch die Reinigung des Proteins konnte optimiert werden und erste Kristallisationsansätze wurden bereits gemacht. Eine mögliche Funktion von Neq014 als spannungsabhängiger Anionenkanal könnte mit der Regulation des Metaboliten- bzw. Energieflusses über die Membran von N. equitans einhergehen. Auch im Falle einer Trennung von seinem Wirt I. hospitalis könnte das Protein eine wichtige Rolle spielen.
Insgesamt betrachtet schaffen die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse die Grundlage für die Expression und Reinigung von Membranproteinen der archaeellen Organismen I. hospitalis und N. equitans und können als Startpunkt für weiterführende Untersuchungen genutzt werden.

Translation of the abstract (English)

In this study an efficient heterologous expression system for membrane proteins of the archaeal organisms I. hospitalis and N. equitans should be identified and established. Therefore suitable candidates from both organisms were selected after bioinformatical analyses. For heterologous expression prokaryotic as well as eukaryotic systems were tested.
Despite various optimization attempts it was not possible to overexpress membrane proteins from I. hospitalis successfully or in adequate quality in E. coli. Moreover, two archaeal systems (P. furiosus and T. kodakarensis) were also not suitable for a heterologous expression. In contrast eukaryotic expression systems showed variable success for the putative MFS transporter Iho0391. The expression in an insect cell line led to a recombinant protein of poor quality. The expression in Pichia pastoris led to a homogeneous protein which could be used for purification and first functional studies. Together with an homology model of this protein the results provide first indications for a possible ATP transport by Iho0391. Maybe even an energy transfer from I. hospitalis to N. equitans is mediated via this putative MFS protein.
A participation in the energy transport (in Ignicoccus itself or to its symbiont Nanoarchaeum) was attributed to the eight identified MFS transporters in the genome of I. hospitalis. Homologous MFS proteins from other Archaea were heterologously expressed in E. coli to shed light on the function of MFS transporters from I. hospitalis. Therefore, the putative MFS protein Tko1655 from T. kodakarensis - a homolog of Iho0800- was selected. Both, expression and purification were successful but functional studies have not been executed so far. The generated homology model indicates a possible involvement in amino acid metabolism.
The putative C4-dicarboxylate transporter Neq014 from N. equitans could be expressed in E. coli after codon optimization. The purification of the protein was optimized and first crystallisation trials were carried out. The possible function as voltage-dependent anion channel could be associated with the regulation of metabolic or energetic fluxes along the membrane of N. equitans. Furthermore, the protein could play an important role after separation from its host I. hospitalis.
With this work a basis for the expression and purification of membrane proteins of the archaeal organisms I. hospitalis an N. equitans was achieved and the results can now be used as a starting point for further investigations.

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