Metastasis is the major cause of cancer-related deaths. Occult cancer cells when found in the
bone marrow of patients with carcinomas have been termed disseminated cancer cells (DCCs)
and when found in the blood circulating tumor cells (CTCs). CTCs and DCCs may comprise
metastasis-initiating cells and surrogate markers for minimal residual disease (MRD) after
curative surgery of the primary ...
Abstract (English)
Metastasis is the major cause of cancer-related deaths. Occult cancer cells when found in the bone marrow of patients with carcinomas have been termed disseminated cancer cells (DCCs) and when found in the blood circulating tumor cells (CTCs). CTCs and DCCs may comprise metastasis-initiating cells and surrogate markers for minimal residual disease (MRD) after curative surgery of the primary tumor. Numerous studies have shown that the presence of DCCs in bone marrow or CTCs in blood detected at time of curative surgery or during the follow-up of the patient put the patients at risk for disease progression and death. Therefore, there is a medical need to better characterize these cells and identify early oncogenic changes that drive metastatic progression. Fusion genes have been shown to be among the very early genomic changes necessary for cancer progression, as demonstrated for the TMPRSS2-ERG rearrangement in prostate cancer, but the identification of these structural variations has been challenging until now, especially in carcinomas, due to the lack of methods able to provide high resolution. Therefore, this work aimed to develop a method for the enrichment of breakpoint sequences that can be applied to DCCs and CTCs. Since these cells are extremely rare the method should enable fusion gene identification in single cells. The technique was established as downstream application of a deterministic method to amplify the genome of single cells. The method was based on the reduction of genome complexity and subtractive hybridization. Reduction of complexity was achieved by portioning the genome into ten fractions based on deterministic fragment selection. Several approaches of subtractive hybridization were subsequently compared and applied. In order to establish the technique, single cells derived from the K562 cell line (Tester), harboring the BCR-ABL gene fusion, and a pool of unrelated lymphocytes (Driver) were used. The enrichment of the breakpoint fusion was monitored by quantitative PCR which demonstrated an enrichment of 1664-fold, sufficient to detect fusion sequences by low coverage sequencing. Thus combination of genome fractioning with subtractive hybridization is a valid approach for the enrichment of breakpoint sequences and could be applied for the genetic characterization of CTCs and DCCs. Future applications of the method might include monitoring cancer specific sequences during the course of therapy of solid cancers, as it is routinely performed for the BCR-ABL fusion gene to monitor therapy response and disease remission, or the identification of novel therapy targets, such as neo-antigens.
Translation of the abstract (German)
Metastasierung ist die Hauptursache der durch Krebs verursachten Todesfälle. Gestreute, aber schwer nachweisbare Krebszellen, die z. B. im Knochenmark von Patienten mit Karzinomen gefunden werden können, werden disseminierte Krebszellen (DCC) genannt. Wenn Krebszellen im Blut von Patienten gefunden werden, spricht man von zirkulierenden Tumorzellen (CTCs). CTCs und DCCs gelten als Kandidaten für ...
Translation of the abstract (German)
Metastasierung ist die Hauptursache der durch Krebs verursachten Todesfälle. Gestreute, aber schwer nachweisbare Krebszellen, die z. B. im Knochenmark von Patienten mit Karzinomen gefunden werden können, werden disseminierte Krebszellen (DCC) genannt. Wenn Krebszellen im Blut von Patienten gefunden werden, spricht man von zirkulierenden Tumorzellen (CTCs). CTCs und DCCs gelten als Kandidaten für Metastasen-bildende Vorläuferzellen und sind daher Surrogatmarker für die minimale Resterkrankung (MRD) nach kurativer Operation des Primärtumors. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass der Nachweis von DCCs im Knochenmark oder CTCs im Blut während einer kurativen Operation oder während der Nachsorge des Patienten mit einem erhöhten Risiko für Krankheitsprogression und Tod einhergeht. Daher besteht ein medizinischer Bedarf, diese Zellen besser zu charakterisieren, sowie frühe onkogene Veränderungen zu identifizieren, welche die Metastasierung antreiben. Manche Fusionsgene gehören zu den sehr frühen genomischen Veränderungen, die für die Krebsprogression verantwortlich sind, was am Beispiel der TMPRSS2-ERG-Translokation bei Prostatakrebs gezeigt wurde. Doch aufgrund des Mangels an hochauflösenden Methoden, ist die Identifizierung dieser strukturellen Veränderungen, insbesondere bei Karzinomen, bisher eine Herausforderung. Daher war das Ziel dieser Arbeit ein Verfahren zur Anreicherung von Sequenzbruchpunkten zu entwickeln, welches für DCCs und CTCs angewendet werden kann. Da diese Zellen extrem selten sind, sollte dieses Verfahren die Identifizierung von Fusionsgenen in einzelnen Zellen ermöglichen. Die Technik wurde als nachgeschaltete Anwendung eines Genomamplifikationsverfahrens etabliert, bei dem die genomische DNA einzelner deterministisch (d.h. nicht zufällig) Zellen vermehrt wird. Die Technik basierte auf der Reduzierung der Genomkomplexität und der subtraktiven Hybridisierung. Die Reduzierung der Komplexität wurde durch das Portionieren des Genoms in zehn Fraktionen erreicht und basiert auf einer deterministischen Fragment Selektion. Mehrere Ansätze der subtraktiven Hybridisierung wurden anschließend verglichen und angewandt. Um die Technik zu etablieren, wurden einzelne Zellen der Zelllinie K562 (Tester), welche die BCR-ABL-Gen-Fusion beherbergen, und ein Zellpool aus Lymphozyten (Driver) verwendet. Die Anreicherung der Sequenzbruchpunkte wurde durch eine quantitative PCR überwacht. Es wurde eine 1664-fache Anreicherung erreicht, die es erlaubt Fusionssequenzen mittels einer Sequenzierung bei niedriger Abdeckung zu detektieren. Die Kombination von Genomfraktionierung mit einer subtraktiven Hybridisierung ist also ein zuverlässiger Ansatz für die Anreicherung von Sequenzbruchpunkten und könnte für die genetische Charakterisierung von CTCs und DCC-Strukturen angewendet werden. Zukünftige Anwendungen des Verfahrens könnten die Verlaufskontrolle krebsspezifischer Sequenzen während einer Therapie bei soliden Krebsarten umfassen, wie sie bereits routinemäßig für das BCR-ABL-Fusionsgen bei der CML durchgeführt wird. Ebenso könnte sie für die Identifizierung neuer Therapieziele, wie beispielsweise für neo-Antigene, eingesetzt werden.
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