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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-346065
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 28 June 2017 |
| Referee: | Prof.Dr. Thomas Dresselhaus |
| Date of exam: | 27 June 2016 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Pflanzenwissenschaften > Lehrstuhl für Zellbiologie und Pflanzenphysiologie (Prof. Dr. Klaus Grasser) |
| Keywords: | Gametogenese, kleine RNAs, Argonaute-Proteine, RNAseq |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 34606 |
Abstract (English)
The life cycle of flowering plants alternates between a diploid multicellular sporophyte generation and a highly reduced haploid gametophyte generation located within the reproductive tissues of the sporophyte. Emerging evidence indicates that the transition from sporophyte to a gametophytic life phase and the acquisition of reproductive fate is marked by extensive epigenetic reprogramming ...
Abstract (English)
The life cycle of flowering plants alternates between a diploid multicellular sporophyte generation and a highly reduced haploid gametophyte generation located within the reproductive tissues of the sporophyte. Emerging evidence indicates that the transition from sporophyte to a gametophytic life phase and the acquisition of reproductive fate is marked by extensive epigenetic reprogramming employing distinct members of the ARGONAUTE (AGO) family of proteins with roles in RNA-directed DNA methylation (RdDM) and heterochromatin formation. Nevertheless, almost nothing is known about RNA silencing machinery components and small noncoding RNAs associated with epigenetic reprogramming and the acquisition of gametic cell fate.
The aim of this work was the detailed investigation of two RdDM-associated Argonaute genes (AGO8 and AGO9) regarding their expression pattern and function in the female reproductive lineage of Arabidopsis thaliana. Furthermore, a specialized Arabidopsis cell line with an egg cell-like transcriptome was generated to enable the identification of small RNAs and RNA silencing machinery components potentially associated with female reproductive fate.
RT-PCR based expression studies were performed for all ten Arabidopsis AGO genes, confirming that AGO5, AGO8 and AGO9 are predominantly expressed in floral tissues containing reproductive lineages, while other AGO genes are more or less ubiquitously expressed. Protein abundance was investigated by Western Blots using peptide antibodies available for six AGOs andp09 revealed that AGO5 and AGO9 are strongly represented in reproductive organs and in the egg cell-like callus. To investigate AGO8 and AGO9 promoter activities and the presence of AGO8 and AGO9 proteins in more detail during female gametophyte development, transgenic Arabidopsis reporterlines were generated and whole-mount immunolocalization experiments were performed. These studies showed that the AGO8 promoter is only active in the egg cell. Nevertheless, AGO8 expression only yielded aberrant spliced mRNA and a GFP-AGO8 fusion protein was not detectable in egg cells expressing AGO8p:GFP-AGO8, suggesting that AGO8 represents a pseudogene.
AGO9 promoter-reporter lines showed activity in the nucellus cells, the megaspore mother cell (MMC) and the functional megaspore (FM) of young ovules. In the mature female gametophyte, AGO9 promoter activity was detectable in the egg cell, the central cell and the chalazal region of the ovule. This is in remarkable contrast to results obtained by AGO9 whole-mount immunolocalization and expression of the GFP-AGO9 fusion protein: AGO9 was neither detectable in the MMC and FM nor in the egg cell nor central cell. The occurrence of aberrant splicing by intron retention in AGO9 mRNA, emerging during ovules maturation, and the results obtained from ectopic expression of correctly spliced AGO9 cDNA in the egg cell suggests that both, developmentally regulated differential splicing and decreased AGO9 protein stability is responsible for the lack of AGO9 protein in the egg cell. A few plants were obtained expressing GFP-AGO9 in the egg cell, which did, however, not correlate with developmental defects in the female gametophyte or in developing seeds. The impact of ectopic GFP-AGO9 on DNA methylation in the egg cell remains to be investigated.
To identify protein coding genes and small noncoding RNAs possibly involved in the acquisition of female reproductive fate or in egg cell specification a specialized transgenic Arabidopsis cell line with egg cell-like expression profile was established by ectopically expressing the transcription factor RKD2. Compared to the control cell line 5,511 genes were classified as differentially expressed by RNA-seq. Quantitative real-time PCR with eighteen selected genes confirmed mRNA-Seq expression data. A global look at genes involved in small RNA pathways revealed several differentially expressed genes in RKD2-induced cell line, including upregulated genes encoding the DNA methyltransferase DOMAINS REARRANGED METHLYTRANSFERASE 1 (DRM1), the DOUBLE-STRANDED RNA BINDING PROTEIN 3 (DRB3), the HISTONE DEACETLYLASE 18 (HDA18), the putative chromatin remodeling protein CHROMATIN REMODELING 34 (CHR34) and a so far undescribed DNA-directed RNA polymerase V subunit 5A-like gene.
Small RNA profiling in the RKD2-induced cell line revealed noticeable differences compared to the control callus. The most abundant group of small RNAs in the control callus are miRNAs, whereas the biogenesis of siRNAs from transposable element (TE) transcripts is dominant in the egg cell-like callus. TE-derived siRNAs of the Ty3/Gypsy superfamily of long terminal repeat retrotransposons, containing members of the ATHILA, ATLANTYS, and ATGP family, form the largest fraction of siRNAs, supporting the idea that the plant reproductive lineage is protected by siRNAs against the activity of TEs. This is in line with the observation that aligned reads to respective TE transcripts are not present in the mRNA-Seq data of the egg cell-like cell line. Differential expression analysis of miRNAs revealed 96 miRNAs being at least up- or down regulated with a log2 fold change of 2, including only 9 miRNAs upregulated in the RKD2-induced callus. Furthermore, 32 novel miRNAs were discovered, with 20 miRNAs being derived from known miRNA precursors while 12 miRNAs are completely novel. Target gene predictions of differential expressed miRNAs revealed several inverse correlations between miRNA and mRNA target expression levels in both the egg cell-like callus and the control callus.
The discovery of so far undescribed transcripts in the egg cell-like cell line encoding small RNA pathway components involved in chromatin modification, together with the identification of differentially expressed known and novel small noncoding RNAs open up interesting possibilities for future investigations regarding their contribution to the acquisition of reproductive fate and egg cell specification.
Translation of the abstract (German)
Der Lebenszyklus der Blütenpflanzen ist durch einen Generationswechsel geprägt. Der diploide und mehrzellige Sporophyt wechselt sich mit dem stark reduzierten, haploiden Gametophyten ab, welcher sich in den reproduktiven Geweben des Sporophyten befindet. Neuere Erkenntnisse weisen darauf hin, dass der Übergang vom Sporophyten zur gametophytischen Lebensphase und der Erwerb der Fähigkeit zur ...
Translation of the abstract (German)
Der Lebenszyklus der Blütenpflanzen ist durch einen Generationswechsel geprägt. Der diploide und mehrzellige Sporophyt wechselt sich mit dem stark reduzierten, haploiden Gametophyten ab, welcher sich in den reproduktiven Geweben des Sporophyten befindet. Neuere Erkenntnisse weisen darauf hin, dass der Übergang vom Sporophyten zur gametophytischen Lebensphase und der Erwerb der Fähigkeit zur Reproduktion durch eine weitgehende epigenetische Neuprogrammierung des Genoms gekennzeichnet sind. Dabei sind bestimmte Mitglieder der ARGONAUTE (AGO) Proteinfamilie beteiligt. Diese spielen eine Rolle beim Prozess der RNA gesteuerten DNA-Methylierung (RdDM, RNA-directed DNA methylation). Trotz dieser Erkenntnisse ist wenig darüber bekannt, welche Komponenten der RNA- silencing Maschinerie und kleinen nicht-kodierenden RNAs an der epigenetischen Reprogrammierung in reproduktiven Geweben und am Erwerb eines gametischen Zellschicksals beteiligt sind.
Ziel dieser Arbeit war die detaillierte Untersuchung zweier RdDM-assoziierter AGO Proteine (AGO8 und AGO9) bezüglich ihres Expressionsmusters und ihrer Funktion in der weiblichen Keimbahn von Arabidopsis thaliana. Darüber hinaus wurde eine spezialisierte Arabidopsis Zelllinie mit einem eizellähnlichen Transkriptom erzeugt, um die Identifizierung von kleinen RNAs und RNA-silencing Komponenten bei der weiblichen Gametenbildung zu ermöglichen.
Für alle zehn Arabidopsis AGO Gene wurden RT-PCR basierte Expressionsstudien durchgeführt, diese bestätigten dass AGO5, AGO8 und AGO9 überwiegend in Blütengeweben, welche reproduktive Zellen enthalten, exprimiert sind. Im Gegensatz dazu kommen alle anderen AGOs mehr oder weniger ubiquitär vor. Die Präsenz von AGO-Proteinen wurde mittels Western Blot untersucht, wozu verfügbare Peptidantikörper gegen sechs AGO Proteine verwendet wurden. Diese Untersuchung ergab, dass AGO5 und AGO9 in reproduktiven Organen und in der eizellähnliche Zelllinie verstärkt vertreten sind. Um die Promoteraktivitäten und die Proteinpräsenz von AGO8 und AGO9 während der Entwicklung des weiblichen Gametophyten eingehender zu untersuchen, wurden transgene Arabidopsis Reporterlinien generiert und eine immunhistologische Untersuchung (whole mount-immunolocalization) durchgeführt. Diese Studien ergaben, dass der AGO8 Promoter ausschließlich in der Eizelle aktiv ist. Nichtsdestotrotz ergab die Expression von AGO8 lediglich aberrant gespleißte mRNA. Auch in Eizellen die AGO8p:GFP-AGO8 exprimierten, konnte kein GFP-AGO8 Fusionsprotein nachgewiesen werden, was darauf hinweist, dass es sich bei AGO8 um ein Pseudogen handelt.
AGO9 Promoter-Reporter-Linien zeigten Aktivität in den Nucelluszellen, in der Megasporenmutterzelle (megaspore mother cell, MMC) und der funktionellen Megaspore (FM) von jungen Samenanlagen. Im reifen weiblichen Gametophyten konnte AGO9 Promoteraktivität in der Eizelle, der Zentralzelle und der chalazalen Region der Samenanlagen nachgewiesen werden. Dies ist ein bemerkenswerter Unterschied zu den Ergebnissen der Immunolokalization und der Expression des GFP-AGO9 Fusionsproteins. AGO9 war weder in der MMC oder FM noch in der Eizelle oder Zentralzelle nachweisbar. Das Auftreten aberranten Spleißens mit Intron Retention in der AGO9 mRNA während der Reifung der Samenanlagen und die Ergebnisse der ektopischen Expression der korrekt gespleißten AGO9 mRNA in der Eizelle weisen darauf hin, dass sowohl entwicklungsspezifisch reguliertes alternatives Spleißen als auch verminderte Proteinstabilität für das Fehlen des AGO9-Proteins in der Eizelle verantwortlich sind. Nur wenige Pflanzen mit GFP-AGO9 Expression in der Eizelle konnten erzeugt werden, diese Expression korrelierte aber nicht mit Entwicklungsdefekten im weiblichen Gametophyten oder im sich entwickelnden Samen. Der Einfluss von ektopisch exprimiertem GFP-AGO9 auf die DNA-Methylierung in der Eizelle bleibt noch zu untersuchen.
Um protein-kodierende Gene und kleine nicht-kodierende RNAs mit möglicher Beteiligung an Prozessen der Zellspezifizierung im weiblichen Gametophyten identifizieren zu können, wurde eine spezialisierte transgene Arabidopsiszellline mit eizellähnlichem Expressionsprofil erzeugt, indem der Transkriptionsfaktor RKD2 ektopisch exprimiert wurde. Im Vergleich zur Kontrollzelllinie wurden 5.511 Gene als differentiell exprimiert identifiziert. Quantitative real-time PCR Analysen mit achtzehnzehn ausgewählten Genen bestätigte die mRNAseq-Expressionsdaten. Ein allgemeiner Blick auf Gene der RNA-silencing Maschinerie enthüllte einige differentiell exprimierte Gene in der RKD2-induzierten Zelllinie, so zum Beispiel hochregulierte Gene die für Proteine kodieren wie die DNA-methyltransferase DOMAINS REARRANGED METHLYTRANSFERASE 1 (DRM1), das Doppelstrang-RNA-Bindeprotein the DOUBLE-STRANDED RNA BINDING PROTEIN 3 (DRB3), die HISTONE DEACETLYLASE 18 (HDA18), das mögliche Chromatinremodellierungsprotein CHROMATIN REMODELING 34 (CHR34) und ein bisher nicht beschriebenes Gen welches der Untereinheit 5A der RNA-Polymerase V ähnelt.
Die Untersuchung der kleinen RNAs in der RKD2-induzierten Zelllinie zeigt eindeutige Unterschiede im Vergleich zum Kontrollkallus. Die häufigste Gruppe kleiner RNAs im Kontrollkallus sind miRNAs, wohingegen im eizellähnlichen Kallus die Biogenese von siRNAs aus mRNAs transposabler Elemente (TEs) vorherrscht. TE-abgeleitete siRNAs der TY3/Gypsy Überfamilie (TEs mit long terminal repeats), welche Mitglieder der ATHILA, ATLANTYS, und ATGP Familie beinhalten, stellen dabei den größten Teil dar, was die Vorstellung unterstützt, das pflanzliche Keimzellen durch siRNAs gegen Transposonaktivität geschützt sind. Die Beobachtung, dass in den mRNA Sequenzdaten keine reads der entsprechenden TEs zu finden sind unterstützt ebenfalls diese Idee. Analyse der differentiellen Expression von miRNAs ergab 96 miRNAs die mindestens um einen log2 Faktor von zwei hoch- oder runterreguliert sind, wobei lediglich neun miRNAs im RKD2-induzierten Kallus hochreguliert sind. Weiterhin wurden 32 neuartige miRNAs entdeckt, wovon 20 aus bereits bekannten miRNA-Vorläufern entstehen, während 12 komplett neuartig sind. Die Voraussage möglicher Zielgene differentiell exprimierter miRNAs ergab einige inverse Korrelationen zwischen miRNA und mRNA Expressionslevels im eizellähnlichen und auch im Kontrollkallus.
Die Entdeckung von bisher nicht beschriebenen Transkripten in der eizellähnlichen Zelllinie, die für sRNA Maschinerie-Komponenten codieren und die an Chromatinmodifikationen beteiligt sind, zusammen mit der Identifizierung differentiell exprimierter bekannter und neuartiger kleiner nicht-kodierender RNAs eröffnet neue, interessante Möglichkeiten für zukünftige Untersuchungen. Diese könnten neue Erkenntnisse darüber hervorbringen, wie Zellen ein reproduktives Zellschicksal annehmen und wie die Spezifizierung der Eizelle vonstattengeht.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 15:38
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