Bakterien gehören zu den ersten und ältesten Lebewesen auf der Erde und aufgrund ihrer Allgegenwärtigkeit ist der Mensch permanent in direktem Kontakt mit ihnen. In dieser Arbeit wird einem Abbauprodukt der Gram-negativen Bakterien, den sogenannten Endotoxinen, spezielle Aufmerksamkeit gewidmet. Diese sind der Hauptbestandteil der äußeren Membran von Gram-negativen Bakterienzellen und werden während des Wachstums oder beim Absterben und der Lyse freigesetzt. Endotoxine sind für den Menschen generell nicht gesundheitsschädlich, solange sie nicht in den Blutkreislauf eingetragen werden. In diesem Fall können sie jedoch zu schwerwiegenden pathogenen Wirkungen führen (z.B. Sepsis). Ein potentielles Risiko der Übertragung in den Blutkreislauf ist beispielsweise bei der Injektion von Medikamenten gegeben. Um dieses Risiko zu minimieren, sind Hersteller von injizierbaren Medikamenten (Parenteralia) verpflichtet, diese streng auf Endotoxin-Kontaminationen zu überprüfen. Hierzu wird üblicherweise der „Limulus Amöbozyten Lysat“ Test verwendet. Dieses Testsystem basiert auf enzymatischen Reaktionen, die der Blutgerinnungskaskade von Pfeilschwanzkrebsen entstammen. Aufgrund der Sensitivität und Anwenderfreundlichkeit stellt diese Methode seit Jahren den „Goldstandard“ zur Bestimmung von Endotoxinen dar. Seit neuestem werden jedoch Unstimmigkeiten während der Testung von biopharmazeutischen Medikamenten beobachtet. In bestimmen Medikamenten konnten die Positivkontrollen nicht innerhalb bestimmter Akzeptanzkriterien detektiert werden. Dieser Effekt wird als „Low Endotoxin Recovery (LER)“ bezeichnet und führt zu Bedenken auf Anwender- und Behördenseite, ob diese Testmethode weiterhin zuverlässig und anwendbar ist.
In dieser Arbeit wurde die Detektierbarkeit von Endotoxin in biopharmazeutischen Formulierungen mittels Limulus-basierten Testmethoden untersucht, um die Ursachen des LER-Phänomens zu verstehen und die gegenwärtigen Testmethoden zu optimieren. Die präsentierten Daten machen deutlich, dass allgemein verwendete Formulierungsbestandteile der Medikamente den LER-Effekt verursachen können. Als Hauptursache wurde die simultane Anwesenheit von Tensiden und Chelatoren identifiziert. Des Weiteren wird gezeigt, dass LER ein zeitabhängiges Phänomen ist und die Reaktionsgeschwindigkeit hauptsächlich von der Konzentration des Chelators in der Probenmatrix abhängt. Darüber hinaus wurden verschiedene Endotoxine untersucht, die aufgrund ihrer strukturellen Heterogenität unterschiedliche Empfindlichkeiten hinsichtlich der Detektierbarkeit aufweisen. Zusammengenommen deuten die Daten darauf hin, dass sich das Endotoxin in einem zweistufigen Prozess in Tensidmizellen der Probenmatrix einlagert und somit für die Detektion maskiert ist. Mittels dieser Arbeitshypothese wurde eine „Toolbox“, mit verschiedenen amphiphilen und chaotropen Reagenzien zur Demaskierung des Endotoxins entwickelt. Schließlich wird gezeigt, dass durch eine gezielte
Probenvorbereitung der LER-Effekt aufgehoben und das Endotoxin mit herkömmlichen Limulus-basierten Testmethoden wieder detektiert werden kann.

Bacteria are one of the first and oldest living organisms on earth and due to their ubiquity, humans are permanently in close contact to them. This work focuses on special breakdown products of Gram-negative bacteria so-called endotoxins. Endotoxins are the major component of the outer membrane of Gram-negative bacteria. They are released during growth or death and lysis of the bacterial cell. Endotoxins are usually not hazardous to man, as long as they do not enter the circulating blood system. However, if for example endotoxins enter the blood system they can lead to severe pathogenic effects like sepsis. One prominent risk is the accidental injection of contaminated drug products. In order to reduce this risk, manufacturers of parenteral drug products are forced to meticulously control their products before they are released to the market. To this end, Limulus Amebocyte Lysate (LAL) assays have been the gold standard for detection of bacterial endotoxins since years. These assays are based on enzymatic reactions derived from the blood coagulation cascade in horseshoe crabs. Most quality control departments in pharmaceutical industry have established such methods to release their drug products, because these assays enable fast and sensitive results. However, in the recent past inconsistencies during testing of biopharmaceutical drug products have been observed. In certain drug products, positive controls of endotoxin were not detectable within given acceptance criteria. This effect is called Low Endotoxin Recovery (LER) and users as well as authorities are concerned about the reliability of the existing test procedures.
In this work, the detectability of endotoxin in biopharmaceutical drug product matrices using Limulus-based detection systems was analyzed to understand the phenomenon of LER and to optimize existing test procedures. The results show that common formulation components of biopharmaceutical drug products are capable to induce LER. The minimum prerequisite is the simultaneous presence of surfactants and complex forming agents. It is demonstrated that the occurrence of LER is time-dependent and that the reaction rate of LER is substantially depending on the concentration of the complex forming agents in the sample matrix. Moreover, endotoxins from different sources were studied, because their structural heterogeneity may lead to different masking susceptibilities. Together, these results indicate that LER is caused by masking of endotoxin leading to an alteration of its supramolecular structure, in which endotoxins are embedded in surfactant micelles. The further elucidation of a two-step LER reaction mechanism served as a basis for the development of a toolbox including amphiphilic and chaotropic reagents, which enables the demasking of endotoxin. In conclusion, the dedicated sample treatment using such reagents allows the detection of LER-affected endotoxin by Limulus-based detection methods.