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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-362803
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.36280
Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
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Open Access Type: | Primary Publication |
Date: | 30 October 2017 |
Referee: | PD Dr. Anja-Kathrin Wege |
Date of exam: | 27 October 2017 |
Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Frauenheilkunde und Geburtshilfe (Schwerpunkt Frauenheilkunde) |
Keywords: | Mammakarzinom, breast cancer, targeted therapy, ADCC, xCelligence, FACS, BT-474, JIMT-1, ZR.75.1, T47D, MCF7, Her2, ErbB2, Her4, ErbB4, anti-HER2-Targeting, Trastuzumab, Pertuzumab, Tamoxifen, Lapatinib, Ab1479 |
Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
Status: | Published |
Refereed: | Yes, this version has been refereed |
Created at the University of Regensburg: | Yes |
Item ID: | 36280 |
Abstract (German)
Seit 2006 bilden antigenspezifische Therapien in Kombination mit einer klassischen Chemotherapie eine entscheidende Komponente sowohl in der adjuvanten wie auch neoadjuvanten Behandlung von Patientinnen mit einem Her2+ Brustkrebs. Trotz der intensiven Forschungsbemühungen in der vergangenen Dekade sind die Wirkmechanismen der therapeutischen Antikörper immer noch nicht vollständig geklärt. Die ...
Abstract (German)
Seit 2006 bilden antigenspezifische Therapien in Kombination mit einer klassischen Chemotherapie eine entscheidende Komponente sowohl in der adjuvanten wie auch neoadjuvanten Behandlung von Patientinnen mit einem Her2+ Brustkrebs. Trotz der intensiven Forschungsbemühungen in der vergangenen Dekade sind die Wirkmechanismen der therapeutischen Antikörper immer noch nicht vollständig geklärt.
Die dem klinischen Respons bzw. einer Resistenz zugrunde liegenden zellulären, molekularen und immunologischen Ursachen sind vielfältig und individuell unterschiedlich, wobei die Familie der ErbB-Rezeptoren hierbei, aufgrund ihrer wechselseitigen Signalverknüpfung, sicherlich eine zentrale Bedeutung einnimmt. Aufgrund seiner ambivalenten Wirkungsweise mit einerseits pro-proliferativer (tumorigener) und andererseits aber pro-apoptotischer (anti-tumorigener) Komponente, rückte der Her4-Rezeptor in den Fokus des wissenschaftlichen Interesses.
Vor diesem Hintergrund war es Ziel dieser Promotionsarbeit die direkten und indirekten Wirkmechanismen einer Target-spezifischen Behandlung von Mammakarzinomzellen unter Berücksichtigung des Her2- und Her4-Rezeptorexpressionsprofils näher zu charakterisieren. Im Folgenden werden die Ergebnisse aus den unterschiedlichen Fragestellung erläutert.
I. Direkte Wirkmechanismen von therapeutischen Antikörpern
Als Ausgangspunkt für die weiterführenden Untersuchungen konnte für die therapeutischen anti-Her2 Antikörpern Trastuzumab und Pertuzumab auf verschiedenen zellulären Ebenen eine signifikante Tumorsuppression nachvollzogen und quantifiziert werden. Entsprechend reduzierte sich beispielsweise der Anteil der proliferierenden BT-474 Zellen von 25,3 % hochsignifikant auf 6,7 % nach einer 48-stündigen Behandlung mit 10 µg/ml Trastuzumab. Während der Zellmetabolismus in Folge einer Applikation dieses therapeutischen Antikörpers ebenfalls hochsignifikant reduziert wird, induziert er jedoch lediglich im geringem Ausmaß Apoptose. Der Anteil der avitalen Zellen steigt hierbei z. B. maximal um 3,7 Prozentpunkte auf 9,2 %. Weiterhin ließ sich in vitro die klinische Erfahrung bestätigen, dass Mammakarzinome sowohl intrinsische Resistenzen gegenüber therapeutischen Antikörpern aufweisen (JIMT-1 / ZR-75.1) oder aber auch unter Langzeittherapie z. T. desensibilisiert werden können (BT-474Resistent). Mögliche Ursachen dieser Resistenzentwicklung wurden mittels Charakterisierung des Expressionsprofil der zu therapierenden Zielantigene sowie der Antikörper-Bindungskapazität näher untersucht. Hierbei exprimieren die BT-474Resistent Zellen, obgleich sie auf eine Trastuzumabbehandlung nicht mehr reagieren, in einem vergleichbaren Ausmaß Her2 und verfügen über eine nicht signifikant unterschiedliche Trastuzumabbindungskapazität wie die Wildtypzellen.
II. Indirekte, Immunsystem-vermittelte Wirkungen von therapeutischen Antikörpern
Im Rahmen der Etablierung der immortalen natürlichen Killerzelllinie NK 3.3 wurde diese phänotypisch und funktionell charakterisiert. Neben dem Nachweis des heterozygoten (V/F) Polymorphismus des Fcγ-Rezeptors CD16, der insgesamt bei 35,3 % der Zellen mit einem heterogenen Expressions¬niveau auf der Zelloberfläche aufgezeigt werden konnte und zu einem mittelaffinen Subtyps der IgG-Bindung führt, wurden die NK 3.3 Zellen durchflusszytometrisch als Nkp46+ bei einem geringen Nachweis von CD56 beschrieben. Eine Expression von CD27 sowie der Fcγ-Rezeptoren CD32 und CD64 ließen sich hingegen nicht detektieren. Funktionell konnte intrazellulär in den natürlichen Killerzellen eine signifikante Synthese von Perforin als zentraler Wirkmechanismus angefärbt werden. In der Immunfluoreszenz gelang zudem der Nachweis einer Colokalisation dieser Effektorzellen an adhärent wachsende Mammakarzinomzellen, die als Targetzellen in eine Cokultur mit NK 3.3 eingebracht wurden.
Der hierzu neu etablierte und eingesetzte einzelzellbasierte Annexin-DAPI-Apoptose-Assay konnte wie die dynamische, real-time xCelligence-Technologie ein großes, signifikantes ADCC-Potential der therapeutischen Antikörper Trastuzumab und Pertuzumab aufzeigen, das sich durch gesteigerte E:T-Ratio beeinflussen ließ.
Der immunmodulatorische Ansatz mit IL-15 zeigte eine deutliche Steigerung der Apoptoserate und gibt damit Hinweise auf mögliche klinische Ansätze. Interessanterweise wird bereits mit der relativ niedrigen Trastuzumabkonzentration von 1,0 μg/ml im Vergleich zu der ansonsten verwendeten zehnfachen Dosis ein gesättigter ADCC-Effekt erreicht.
III. Prädiktive Bedeutung des ErbB4-Rezeptors
Aufgrund der engen subzellulären Vernetzung der Signalwegen der Rezeptoren der ErbB-Familie untereinander und mit weiteren wichtigen Oberflächenrezeptoren des Mammakarzinoms, wie dem Östrogenrezeptor (ERα), war es eine weitere wichtige Fragestellung dieser Arbeit, den prädiktiven Stellenwert einer Expression des Her4-Rezeptors - nicht zuletzt aufgrund seiner ambivalente Funktionsweise - für zielspezifische anti-Her2 bzw. anti-ER Therapieoptionen zu eruieren. Für diese Untersuchungen wurden die klinisch etablierten Substanzen Lapatinib und Tamoxifen sowie die therapeutischen Antikörper Trastuzumab und Pertuzumab eingesetzt.
Anhand von Zellen, die nach epigenetischer Reaktivierung oder semistabiler retroviraler Transfektion den ErbB4-Rezeptor exprimieren, konnte die enge Assoziation der Her4-Coexpression und einer anti-Her2 bzw. anti-ER gerichteten Behandlung aufgezeigt werden. So wiesen die transfizierten Zellen eine signifikante Desensibilisierung gegenüber einer Tamoxifen-Therapie sowohl auf der Ebene der Proliferationshemmung als auch bei der Apoptoseinduktion auf. Auch in parallelen Arbeiten in der Arbeitsgruppe Brockhoff/Wege konnte dieses Ergebnis invers, mit einer Tamoxifen-Sensibilisierung nach Knock-down des Her4-Rezeptors, bestätigt werden. Zurückzuführen scheint diese Assoziation a. e. auf die abspaltbare intrazelluläre Domäne (4ICD) des ErbB4-Rezeptors, der direkt in die Signaltransduktion von ERα eingreifen und als wichtiger Mediator der Tamoxifen-induzierten Apoptose hemmen kann.
Ebenso ließ sich für die Behandlung mit dem Tyrosinkinaseinhibitor Lapatinib eine prädiktive Aussage für eine Her4-Coexpression ableiten. Aus den erhobenen Labordaten ergibt sich, dass eine Her4-Coexpression mit einer verbesserten Sensibilität bzgl. der Apoptoseinduktion durch Lapatinib vergesellschaftet ist. Interessanterweise deuten die Versuchsergebnisse andererseits daraufhin, dass die Her4-Transfektion jedoch zu einem reduzierten Zellzyklusarrest in Folge der Behandlung mit diesem dualen Tyrosinkinaseinhibitor führt.
Für ein verbessertes therapeutisches Potential der monoklonalen Antikörper Trastuzumab und Pertuzumab ergeben sich bei einer bestehenden Her4 Coexpression aus den durchgeführten Experimenten ebenfalls Hinweise, wobei sich das größere Ansprechen sowohl auf die Hemmung der Zellproliferation als auch den Zellmetabolismus erstreckt.
Damit zeigt sich aus den in vitro Ergebnissen dieser Arbeit eine unterschiedliche prognostische Bedeutung abhängig von den eingesetzten Behandlungsansätzen, der zusätzlich sicher auch von unterschiedlicher Co-Expression der ErbB4- und Östrogenrezeptoren in vivo beeinflusst wird. Diese unterschiedliche Einordnung als positiven oder negativen prognostischen Marker für Mammakarzinompatientinnen spiegelt sich auch in den kontroversen Ergebnissen aus klinischen Studien wider.
IV. ErbB4 als therapeutisches Target
Im Fokus des letzten Abschnitts dieser Arbeit stand die Beantwortung der Frage, ob sich der ErbB4-Rezeptor selbst als mögliches Zielantigen einer Antikörpertherapie eignen würde. Obwohl in Vorversuchen sowohl die signifikante Her4-Expression als auch die Bindung des monoklonalen, anti-Her4 Antikörpers mAb1479 an die drei Mammakarzinomzelllinien ZR-75.1, T75D und MCF7 bestätigt werden konnte, zeigte sich in der Evaluierung des direkten zellulären Potentials dieses therapeutischen Antikörpers kaum ein ausgeprägter Effekt. Lediglich der zelluläre Metabolismus reduzierte sich nach der Applikation von mAb1479. Auf Ebene der Proliferation bzw. der Zellvitalität war hingegen, trotz gegenteiliger Publikation, kein Unterschied erkennbar und stellt daher einen potentiellen klinischen Einsatz dieses Antikörpers in Frage.
Die weiterführenden Untersuchungen, die mAb1479 als möglichen Induktor einer immunzellvermittelten Apoptoseinduktion einordnen sollten, zeigten ein nur gering ausgeprägtes ADCC-Potential nach Coinkubation mit der humanen NK 3.3 Zelllinie für diesen anti-Her4 Antikörper. Mit Einsatz muriner Effektorzellen aus Mäusen des Inzuchtstammes CL57/BL6 konnte hingegen bei allen drei Mammakarzinomzelllinien signifikante ADCC-Effekte vermessen werden. Eine Begründung für diese unterschiedliche NK-zellvermittelte Wirkstärke findet sich vermutlich im murinen Fc-Teil von mAb1479. Die Versuche zur Einordnung möglicher ADCC Effekte, die evtl. in Patientinnen zum Tragen kämen, müssten daher mit einem humanisierten mAb1479 erneut durchgeführt werden.
Schlussfolgerung / Ausblick
In der Behandlung des Mammakarzinoms nimmt der ErbB2-Rezeptor schon seit langer Zeit einen zentralen prognostischen Stellenwert ein und ist, trotz klinisch auftretender Resistenzen, ein wichtiges therapeutisches Target. Die erhobenen Daten lassen eine wichtige Bedeutung der Coexpression des Her4-Rezeptors für eine gegen den ErbB2-Rezeptor gerichtete Behandlung vermuten. Aufgrund der Komplexität der zellulären Regulation und um langfristig einen klinischen Nutzen zu erarbeiten, erscheinen weitergehende Forschungsanstrengungen lohnenswert. Dazu sollte jedoch nicht nur die Bestimmung einzelner Zielstrukturen auf der Zelloberflächen, sondern vielmehr ein umfassendes Charakterisierungsprofil der Mammakarzinomzellen gemeinsam mit immunologischen und weiteren Eigenschaften der einzelnen Patientin als Grundlage für die individuelle Therapieplanung genutzt werden. Derart scheint es für die Zukunft möglich, über eine personalisierte Kombination verschiedener Therapieansätze (Chemotherapien, zielspezifische Therapeutika, Immunmodulatoren, etc.) die Prognose von Patientinnen, die an einem Mammakarzinom erkrankten, nicht zu Letzt durch die suffiziente Vermeidung oder Überwindung von Resistenzen, weiter zu verbessen.
Obgleich die Langezeit unterschätzte Rolle des Immunsystem für die medikamentösen Tumortherapie zunehmend in den Vordergrund tritt und auch mit dieser Arbeit unterstrichen werden konnte, sind valide Aussagen schwierig. Die Übertragung von in vitro bzw. ex vivo Untersuchungsergebnissen, wie sie auch hier mit den Cokulturversuchen erhoben wurden, ist auf den Menschen nur eingeschränkt möglich. Da praktische und v. a. ethische Aspekte Studien am Patienten jedoch enge Grenzen setzen, können neuartige translationale Mausmodelle, wie zum Beispiel das in der Arbeitsgruppe Brockhoff/Wege etablierte humanisierte Tumormausmodell, sinnvolle weitere Untersuchungen ermöglichen und damit die die Vielschichtigkeit im menschlichen Organismus wesentlich realistischer abbilden.
Zusammenfassend bleibt somit zu postulieren, dass durch weitere translationale Übertragung von klinischer und biomedizinischer Grundlagenforschung spannende Neuerungen zu erwarten sind und diese die Prognose von Tumorpatientinnen weiter verbessern werden.
Translation of the abstract (English)
Since 2006, antigen-specific therapies in combination with classical chemotherapy have been a key component in the adjuvant and neoadjuvant treatment of patients with Her2+ breast cancer. In the last decade, there have been intensive research efforts in this field. However, the mechanisms of the therapeutic antibodies are still not completely understood. The cellular, molecular and immunological ...
Translation of the abstract (English)
Since 2006, antigen-specific therapies in combination with classical chemotherapy have been a key component in the adjuvant and neoadjuvant treatment of patients with Her2+ breast cancer. In the last decade, there have been intensive research efforts in this field. However, the mechanisms of the therapeutic antibodies are still not completely understood. The cellular, molecular and immunological reasons underlying the clinical response or resistance are manifold and individually different. Herein the family of the ErbB receptors plays a central role since they interact mutually in the signal assignment. Due to its ambivalent effectiveness on the one hand a pro-proliferative (tumorigenic) and, on the other hand, a pro-apoptotic (anti-tumorigenic) component, the Her4 receptor has attracted much attention over recent years. The aim of this thesis was to characterize direct and indirect mechanisms of action of a target-specific treatment of breast carcinoma cells, regarding to the Her2- and Her4- receptor expression profiles.
I. Direct mechanisms of therapeutic antibodies
First of all, a significant tumour suppression could be shown and quantified for the therapeutic anti-Her2 antibodies trastuzumab and pertuzumab on various cellular levels (proliferation, metabolism, survival). Furthermore, clinical experience could be confirmed in-vitro showing that breast carcinomas have both an intrinsic resistance against therapeutic antibodies (JIMT-1 / ZR-75.1) and a desensitization by a long-term treatment (BT-474Resistent). Possible reasons of this resistance development were investigated.
II. Indirect, immune system dependent mechanisms of therapeutic antibodies
The immortal natural killer cell line NK 3.3 was characterized phenotypically and functionally. In 35.3% of the cells, CD16 (FcγRIII) was found in combination with a heterogeneous expression level on the cell surface. The heterozygous (V / F) polymorphism of this Fcγ receptor led to a medium affinity subtype of the IgG binding. The NK 3.3 cells were also described by flow cytometry as Nkp46+ with a low detection of CD56. Functionally, a significant synthesis of perforin as a central mechanism of action could be stained intracellularly in the natural killer cells. By immunofluorescence, it was also possible to detect in co-cultures the colocalization of these effector cells to adherently growing mammary carcinoma cells. The newly established and used single-cell-based annexin DAPI apoptosis assay, like the dynamic, real-time xCelligence technology, demonstrated an ADCC potential (influenced by the E:T ratio) of the therapeutic antibodies trastuzumab and pertuzumab but also revealed a direct cytotoxic effect of NK cells without antibody intervention.
III. Predictive significance of the ErbB4 Receptor
Due to the close subcellular cross-linking of the signalling pathways of the ErbB family and other important surface receptors, such as the estrogen receptor (ERα), another important goal of this work was to determine the predictive value of the Her4 receptor for target-specific anti-Her2 or anti-ER therapy options. The clinically established substances lapatinib and tamoxifen, as well as the therapeutic antibodies trastuzumab and pertuzumab, were investigated herein.
By cells expressing the ErbB4 receptor after epigenetic reactivation or semi-stable retroviral transfection, the close association of Her4 coexpression and an anti-Her2 or anti-ER-directed treatment could be demonstrated. Thus, transfected cells exhibited significant desensitization against tamoxifen treatment at both the proliferation inhibition and apoptotic induction levels.
Similarly, a predictive valuation of a Her4 coexpression could be determined by the treatment with the tyrosine kinase inhibitor lapatinib. The obtained data indicate that Her4 coexpression is associated with improved sensitivity to apoptotic induction by lapatinib. Interestingly, the experimental data indicate that Her4 transfection results otherwise in a reduced cell cycle arrest due to treatment with this dual tyrosine kinase inhibitor. There are also indications for an improved therapeutic potential of the monoclonal antibodies trastuzumab and pertuzumab in presence of a Her4 coexpression.
IV. ErbB4 as a therapeutic target
The focus of the last part was whether the ErbB4 receptor itself would be a possible target for an antibody therapy. First the binding potential of the anti-Her4 antibody mAb1479 on Her4 expressing cell lines was confirmed. Despite these results, the evaluation of the direct cellular potential of this therapeutic antibody showed hardly any effect. Only cellular metabolism was reduced after administration of mAb1479. Contrary to any other publication, these data render a potential clinical use of this antibody. In addition, only a marginal ADCC potential was observed after co-incubation with the human NK 3.3 cell line for this anti-Her4 antibody. By using murine effector cells from mice (tested in respect to the murine Fc part of mAb1479), however, significant ADCC effects could be measured for all three mammary carcinoma cell lines. Further testing should be performed using a humanized version of this antibody.
Conclusion
In the treatment of breast cancer, the ErbB2 receptor has assumed a central prognostic value for a long time. It is also an important therapeutic target, despite clinically occurring resistances. The obtained results suggest that the co-expression of the Her4 receptor is important for a treatment directed against the ErbB2 receptor. Due to the complexity of the cellular regulation, further research efforts are worthwhile to develop a clinical benefit for the patients in the future. For this, not only the expression of individual target structures on the cell surfaces should be analyzed but rather a comprehensive characterization of the whole tumor profile together with determination of immunological parameters of the individual patient should be performed.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 20:50