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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-365875
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.36587
Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
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Open Access Art: | Primärpublikation |
Datum: | 31 Januar 2018 |
Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Antje J. Baeumner und Prof Dr. Joachim Wegener |
Tag der Prüfung: | 23 Oktober 2017 |
Institutionen: | Nicht ausgewählt |
Stichwörter / Keywords: | Biosensors, mycotoxins, surface plasmon resonance |
Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie |
Status: | Veröffentlicht |
Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
Dokumenten-ID: | 36587 |
Zusammenfassung (Englisch)
Mycotoxins are secondary metabolites of mould, which are ubiquitous in a large variety of food and feed commodities. Thousands of mycotoxins exist, but only a few present significant damages and poisonous properties. Among them, the aflatoxins and ochratoxins are considered to be the most toxic and widely spread in the world and therefore, represent a real threat for human/animal life. Depending ...
Zusammenfassung (Englisch)
Mycotoxins are secondary metabolites of mould, which are ubiquitous in a large variety of food and feed commodities. Thousands of mycotoxins exist, but only a few present significant damages and poisonous properties. Among them, the aflatoxins and ochratoxins are considered to be the most toxic and widely spread in the world and therefore, represent a real threat for human/animal life. Depending on a number of factors like the intake levels, duration of exposure, mechanisms of action, metabolism and defense mechanisms, mycotoxins elicit a wide spectrum of toxicological effects leading to both acute and chronic disease, liver and kidney damage, skin irritation, cancer, immune suppression, birth defects or even death.
To address the adverse effects of mycotoxin contaminants in food and feed, health authorities in many countries all over the world have become active in establishing regulations to protect their citizens and livestock from the potential damages caused by those compounds. The European Commission, the US Food and Drug Administration (FDA), the World Health Organization and the Food and Agriculture Organization of the United Nations have set up regulations and maximum levels for major mycotoxins in foods and feeds. To fulfill expectations of these regulatory limits, there is an increasing need for the development and validation of new, simple, fast and precise methods for toxins detection.
Therefore, this thesis reveals different strategies for rapid, cost-effective and ultrasensitive bioanalysis of two major mycotoxins: aflatoxin M1 and ochratoxin A. Inhibition competitive assays with surface plasmon resonance spectroscopy (SPR, optical technique), quartz crystal microbalance (QCM, acoustic device) and electrochemical based readout were developed and compared. Presented biosensors were challenged in a red wine and milk samples with no need for pre-treatment or pre-concentration of the sample extract.
In order to prevent fouling on the sensor surface by the constituents present in milk samples, the gold surface of the sensor chip was modified and different surface architecture and compared (antifouling polymer brushes and self-assembled monolayer - SAM). Complete resistance to the non-specific interactions was observed for coating with p(HEMA) brushes resulting in two times lower LOD compared to that on thiol SAM. The SPR biosensor for AFM1 allowed for highly sensitive detection in milk with an excellent precision (the average calculated CV was below 4%), limit of detection of 18 pg mL−1 for p(HEMA) brushes and 38 pg mL-1 for thiol SAM and with the analysis time of 55 min. It is worth highlighting that it is
the first time that an SPR chip modified with such polymer brushes was used for real time detection of a small target antigen opening a new avenue for highly precise analysis.
In the case of wine samples tested for OTA detection, a simple but very effective pre-treatment procedure was successfully applied. It was proved that the addition of the 3% of the binding agent poly(vinylpyrrolidone) (PVP) to red wine completely reduces non-specific interactions by binding polyphenolic compounds (which may be responsible for inactivation of antibody and blocking the sensor surface) through hydrogen bonding, making their elimination easier. Moreover, in this study, the authors evaluated the influence of gold nanoparticles (AuNPs) on signal enhancement and thereby biosensor sensitivity. For this purpose two assays were performed: with and without implementation of NPs. Obtained results allowed for OTA detection at concentrations as low as 0.75 ng mL−1 however, its limit of detection was improved by more than one order of magnitude to 0.068 ng mL−1 by applying AuNPs as a signal enhancer.
The combination of indirect competitive assay and AuNPs with QCM-D gave a straightforward tool, which can simultaneously measure frequency and dissipation changes resulting in information about the sensitivity but also about the mass attached to the sensor surface as well as viscoelastic properties and the hydration state of the film. A linear detection range of 0.2–40 ng mL-1 has been achieved with LOD of 0.16 ng mL-1.
The same assay format was also tested in voltammetric detection of mycotoxins using modified gold screen printed electrodes (AuSPE). An excellent LOD of 15 ng mL-1 for OTA and 37 pg mL-1 for AFM1 were obtained. Additionally, AuSPE modified with SAMs based on different types of alkanethiols (long and short chains) were tested and compared in terms of electron transfer resistance.
Proposed biosensors offer vast range of advantages such as high sensitivity (at pg or ng levels), short analysis time (55 min) in comparison to for example, ELISA which require multiple steps that translates to prolonged analysis time, possibility for online monitoring, characterization of binding kinetics, low consumption of primary antibody (cost reduction), excellent antifouling surface and simple pre-treatment procedure.
Combining all most desirable aspects of a good biosensor such as high sensitivity, low costs, short analysis time and simple but effective cleaning-up technique make proposed approaches an important and very promising tools for widespread biosensing applications.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Mykotoxine sind sekundäre Schimmel-Metaboliten, die allgegenwärtig in einer großen Anzahl von Lebensmittel und Futter-Erzeugnissen enthalten sind. Tausende von Mykotoxinen existieren, aber nur einige wenige haben signifikante Schadens- und Vergiftungseigenschaften. Unter diesen sind die Aflatoxine und die Ochratoxine die am meisten toxischen und auch am weitesten verbreiteten, und stellen deshalb ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Mykotoxine sind sekundäre Schimmel-Metaboliten, die allgegenwärtig in einer großen Anzahl von Lebensmittel und Futter-Erzeugnissen enthalten sind. Tausende von Mykotoxinen existieren, aber nur einige wenige haben signifikante Schadens- und Vergiftungseigenschaften. Unter diesen sind die Aflatoxine und die Ochratoxine die am meisten toxischen und auch am weitesten verbreiteten, und stellen deshalb eine reale Gefahr für das menschliche und tierische Leben dar. Abhängig von einer Anzahl von Faktoren wie dem Aufnahme-Niveau, der Dauer der Belastung, dem Wirkungsmechanismus, dem Metabolismus und Schutzmechanismen, Mykotoxine rufen ein weites Spektrum an toxikologischen Effekten hervor, die sowohl zu akuten als auch zu chronischen Krankheiten, Leber und Nieren-Schäden, Hautirritationen, Immunerkrankungen, zu Geburtsschäden und sogar zum Tod führen können.
Um die nachteiligen Effekte der Mykotoxin-Kontamination in Lebensmitteln und Futter zu adressieren, sind Gesundheitsbehörden in vielen Ländern auf der ganzen Welt aktiv, Betimmungen zu erlassen, um ihre Einwohner und den Tierbestand für eine potentiellen Gefährdung durch diese Verbindungen zu schützen. Die europäische Kommission, die US Food and Drug Administration (FDA) als auch die Weltgesundheitsorganisation der Vereinigten Nationen haben Verordnungen erlassen und maximale Niveaus für die Haupt-Mykotoxine in Lebensmitteln und im Futter erlassen. Um die Erwartungen dieser regulatorischen Grenzwerte zu erfüllen, ist es im wachsenden Masse erforderlich, neue, einfache, schnelle und präzise Methoden des Nachweises von Mykotoxinen zu entwickeln.
Aus diesem Grunde werden in der Promotionsarbeit verschiedene Strategien für eine schnelle, kosten-effektive und ultrasensitive Bioanalyse von 2 Haupt-Mykotoxinen: Aflotoxin M1 und Ochratoxin A vorgestellt. Ein Inhibitions-kompetitiver Assay unter Nutzung der Oberflächenplasmonenresonanz (SPR, optische Technik), der Quarzkristall-Mikrowaage (QCM, akustische Technik) sowie ein elektrochemisch-basierter Ansatz werden entwickelt und verglichen. Die vorgestellten Biosensoren wurden in Rotwein und in Milchproben eingesetzt ohne jegliche Vorbereitung oder Anreicherung des Probenextraktes.
Um einen möglichen Faulprozess auf der Sensoroberfläche durch die Bestandteile, die in der Milch vorhanden sind zu verhindern, wird die Goldoberfläche des Sensorchips modifiziert und verschiedene Oberflächenarchitekturen wurden getestet und verglichen (Antifaul-
Polymerbürsten und selbst-organisierende Monoschichten - SAM). Eine komplette Unterdrückung von nicht-spezifischen Wechselwirkungen wurde beobachtet durch eine Beschichtung mit p(HEMA)-Bürsten, was zu einer um den Faktor zwei verringerten LOD verglichen mit den des Thiol-SAM führt. Der SPR-Biosensor für das AFM1 ermöglicht einen hoch-sensitiven Nachweis in der Milch mit einer exzellenten Genauigkeit (der mittlere berechnete CV war unter 4 %), einer Nachweisgrenze von 18 pg/ml für p(HEMA) – Bürsten und 38 pg/ml für das Thiol-SAM und mit einer Analysezeit von 55 min. Es sollte darauf hingewiesen werden, dass damit zum ersten Mal ein SPR-Chip benutzt wurde, der mit solchen Polymerbürsten modifiziert wurde für den Echtzeit-Nachweis eines kleinen Ziel-Antigens, was eine völlig neue Richtung für die hochpräzise Analyse eröffnet.
Im Falle der Weinproben, die für die OTA-Detektion getestet wurden, wurde eine simple aber sehr effektive Vorbehandlungsprozedur angewendet. Es konnte gezeigt werden, dass die Zugabe von 3 % einer Bindungssubstanz ((Poly(vinylpyrrolidon), PVP) zum Rotwein die nichtspezifischen Wechselwirkungen total reduziert, indem die polyphenolischen Verbindungen (die für die Inaktivierung des Antikörpers und dem Blockieren der Sensoroberfläche verantwortlich zu sein scheinen) durch Wasserstoffbrückenbindungen gebunden werden. Dieses Verfahren hat wesentliche Vorteile bei der Eliminierung der polyphenolischen Komponenten im Wein. Des weiteren wurde im Rahmen der Dissertation der Einfluss von Gold-Nanopartikeln (AuNPs) auf die Signalverstärkung und somit die Sensorempfindlichkeit untersucht. Für diesen Zweck wurden zwei Assays entwickelt: mit und ohne Benutzung von NPs. The erhaltenen Ergebnisse erlaubten es, OTA bis zu Konzentrationen von 0,75 ng/ml (Nachweisgrenze) zu detektieren, während die Nachweisgrenze durch die Anwendung von NPs als Signalverstärker um eine Größenordnung auf 0,068 ng/ml verringert werden konnte.
Die Kombination von indirektem kompetitiven Assay und NPs mit QCM-D liefert ein ideales Werkzeug, das simultan die Frequenz und Dissipationsänderungen messen kann, was sowohl zu einer Information über die Empfindlichkeit, über die Masse, die an der Sensoroberfläche angelagert ist, als auch über die visko-elastischen Eigenschaften und den Hydrationszustand des Filmes führt. Ein linearer Nachweisbereich von 0,2 – 40 ng/ml mit einem LOD von 0,16 ng/ml wurde erreicht.
Dasselbe Assayformat wurde auch für eine voltammetrische Detektion der Mykotoxine bei Nutzung von modifizierten gedruckten Goldelektroden (AuSPE) getestet. Ein exzellentes
LOD von 15 ng/ml für OTA und 37 pg/ml für AFM1 wurde erhalten. Zusätzlich wurden AuSPEs modifiziert mit SAMs basierend auf unterschiedlichen Typen von Alkanethiolen (lang- und kurzkettigen) getestet und in Bezug auf den Elektronentransferwiderstand verglichen.
Die vorgeschlagenen Biosensoren bieten sehr vielfältige Vorteile, wie eine sehr hohe Sensitivität (im pg oder ng Bereich), kurze Analysenzeiten (55 Minuten) im Vergleich zu z. B. ELISA, was multiple Schritte benötigt, und dazu führt, das solche Faktoren, wie die Analysenzeit, die Möglichkeit eines on-line-Monitorings, der Charakterisierung von Bindungskinetiken, dem geringen Verbrauch an Antikörpern (Kostenreduktion), der exzellenten Antifaul-Oberfläche und nicht zuletzt mit einer einfachen Vorbereitungsprozedur vorteilhaft sind.
Indem man die wichtigsten Aspekte eines guten Biosensors wie hohe Sensitivität, geringe Kosten, kurze Analysezeit und einfache UND effektive Reinigungstechniken betrachtet, zeigt sich, dass der vorgeschlagene Zugang ein wichtiges und sehr erfolgversprechendes Werkzeug für weitgespannte Biosensor-Anwendungen darstellt.
Metadaten zuletzt geändert: 25 Nov 2020 20:31