| License: Publishing license for publications excluding print on demand (5MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-367443
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.36744
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 11 February 2019 |
| Referee: | Prof. Dr. Bernhard H.F. Weber |
| Date of exam: | 9 February 2018 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Humangenetik |
| Keywords: | XLRS, retinoschisin, Na/K-ATPase, pathomechanism |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 36744 |
Abstract (German)
Bei der X-gebundenen juvenilen Retinoschisis (engl. X-linked juvenile retinoschisis, XLRS) handelt es sich um eine degenerative Erkrankung der Netzhaut, welche auf Grund ihres X-chromosomalen Vererbungsmusters vorwiegend bei Männern auftritt (George et al., 1995). Charakteristisch für die XLRS ist eine Aufspaltung der retinalen Schichten (Schisis) und eine defekte Signalweiterleitung von ...
Abstract (German)
Bei der X-gebundenen juvenilen Retinoschisis (engl. X-linked juvenile retinoschisis, XLRS) handelt es sich um eine degenerative Erkrankung der Netzhaut, welche auf Grund ihres X-chromosomalen Vererbungsmusters vorwiegend bei Männern auftritt (George et al., 1995). Charakteristisch für die XLRS ist eine Aufspaltung der retinalen Schichten (Schisis) und eine defekte Signalweiterleitung von Photorezeptor- zu Bipolarzellen. Ursächlich für diese Erkrankung sind Mutationen im RS1-Gen (Sauer et al., 1997). Das vom RS1-Gen kodierte Protein, Retinoschisin, wird in der Retina spezifisch von Photorezeptoren und Bipolarzellen exprimiert und bindet an die Plasmamembranen dieser Zelltypen. Die Verankerung von Retinoschisin an der Plasmamembran wird dabei von der retinalen Na/K-ATPase vermittelt (Friedrich et al., 2011), welche bereits in einer früheren Studie als ein Interaktionspartner von Retinoschisin identifiziert wurde (Molday et al., 2007).
Der molekulare Pathomechanismus der XLRS und inwiefern die retinale Na/K-ATPase in der XLRS-Pathogenese involviert ist, ist bisher nicht bekannt. Ziel dieser Arbeit war es daher, funktionelle Konsequenzen sowie die strukturelle Basis der Retinoschisin-Na/K-ATPase Interaktion zu untersuchen.
Für die folgenden Studien wurden zunächst die kodierenden Sequenzen für Retinoschisin und eine pathogene Retinoschisin-Variante, RS1-C59S, mit einem Myc-Tag fusioniert und in einen Expressionsvektor kloniert, was die Aufreinigung rekombinanten Retinoschisins ermöglichte. Die aufgereinigten Retinoschisin-Varianten wurden in die weiteren Versuche zur Retinoschisin-Na/K-ATPase Interaktion eingesetzt.
Das erste Projekt hatte zum Ziel, einen möglichen Einfluss von Retinoschisin auf Proteinmengen oder Membranstabilität der Na/K-ATPase in Netzhautexplantaten des RS1-Knock out (Rs1h-/Y) Mausmodells oder in Hek293 Zellen, welche heterolog die retinale Na/K-ATPase exprimierten, aufzuklären. Rekombinantes Retinoschisin hatte in keinem der beiden Modellsysteme einen Einfluss auf Na/K-ATPase Proteinmengen, weder in Gesamtzelllysaten noch in angereicherten Membranfraktionen.
Ein weiteres Projekt befasste sich mit einem möglichen Effekt von Retinoschisin auf die aktive Ionenpumpfunktion der Na/K-ATPase. Rekombinantes Retinoschisin hatte dabei keinen Einfluss auf die ATP-Hydrolyserate oder Substrataffinitäten der Na/K-ATPase in Rs1h-/Y-Netzhautexplantaten. Ebenso hatte es keinen Einfluss auf die Ionentransportaktivität der heterolog in Xenopus leavis Oozyten exprimierten, humanen retinalen Na/K-ATPase.
Im Rahmen des dritten Projekts wurde untersucht, ob Retinoschisin die Na/K-ATPase abhän-gige Signaltransduktion beeinflussen kann. Die Zugabe von Retinoschisin, nicht aber von RS1-C59S, verminderte die Aktivität von c-RAF und ERK1/2, zentraler Komponenten des MAPK (Mitogen-aktivierten Proteinkinase) Signalweges, in Rs1h-/Y Netzhautexplantaten sowie in der humanen Retinoblastom-Zelllinie Y-79. Außerdem verminderte Retinoschisin die Expression der MAPK Zielgene c-FOS und EGR1 in beiden retinalen Modellsystemen. Weitere Studien zur Retinoschisin-abhängigen Regulation von Signalkaskaden fokussierten sich auf Rs1h-/Y Netzhautexplantate. Es zeigte sich, dass die Zugabe von rekombinantem Retinoschisin, nicht aber von RS1-C59S, die Aktivität von Src, welches als initialer Signaltransmitter der Na/K-ATPase beschrieben wurde (Cui und Xie, 2017), mindert. Ebenso verminderte Retinoschisin die Aktivität des Ca2+ Signalweg-Markers Camk2. Die Aktivität des PI3K/AKT Signalwegs, repräsentiert durch Akt, wurde von Retinoschisin nicht beeinflusst. Immunhistochemische Analysen muriner, wildtypischer Netzhäute zeigten überlappende Signale des Retinoschisin-Na/K-ATPase-Komplexes mit Signalen von Gerüstproteinen und Transmittern, denen eine Beteiligung an der Na/K-ATPase-Signalweiterleitung zugesprochen wird.
Des Weiteren wurde der Einfluss von Retinoschisin auf die zelluläre Homöostase untersucht. Die Behandlung von Y-79-Zellen mit rekombinantem Retinoschisin hatte keinen Einfluss auf deren Überlebensrate, Zellgröße oder Proliferation. Jedoch zeigte sich nach Zugabe von re-kombinantem Retinoschisin eine Minderung der apoptotischen Aktivität sowohl in Y-79-Zellen als auch in Rs1h-/Y Netzhautexplantaten. Die Expression des pro-apoptotischen Markergens BAX wurde in beiden Modellsystemen beeinflusst und nach unten reguliert. Ebenso zeigten Y-79 Zellen nach Behandlung mit Retinoschisin eine verminderte Caspase-3-Aktivität. Netzhautexplantate der Rs1h-/Y Maus, die für eine Woche in Gegenwart von Retinoschisin ex vivo kultiviert wurden, zeigten eine deutlich reduzierte Photorezeptordegeneration.
Das letzte Projekt befasste sich mit der Identifikation der Retinoschisin-Interaktionsfläche der Na/K-ATPase. Neun verschiedene Na/K-ATPase-Isozymkombinationen (ATP1A1, ATP1A2, und ATP1A3 in Kombination mit ATP1B1, ATP1B2, oder ATP1B3) wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit, Retinoschisin zu binden, untersucht. Eine Retinoschisin-Bindung fand nur an Na/K-ATPasen, welche die ATP1B2-Untereinheit enthielten, statt. Die Herstellung chimärer ATP1B2-ATP1B1-Untereinheiten ermöglichte es, die Interaktionsstelle weiter auf die extrazelluläre Domäne der ATP1B2-Untereinheit einzuschränken. Mit Hilfe bioinformatischer Analysen wurden anschließend zwei mögliche Protein-Interaktionsregionen auf ATP1B2 identifiziert. Durch gerichtete Mutagenese wurden diese Regionen gezielt entfernt, in dem die entsprechenden Aminosäuresequenzen von ATP1B1 eingefügt wurden. Retinoschisin-Bindeversuche an diese chimären ATP1B2-Mutanten ergaben eine Kanditatenregion für die Retinoschisin-Interaktionsstelle in der zweiten Interaktionsregion, an Aminosäure T240.
Zusammenfassend liefert diese Arbeit neue Einblicke in initiale pathologische Prozesse der XLRS, was die Erforschung neuer therapeutischer Strategien für diese bisher unheilbare Krankheit vorantreiben könnte.
Translation of the abstract (English)
X-linked juvenile retinoschisis (XLRS) is a degenerative disease of the retina which primarily affects males due to an X-chromosomal recessive mode of inheritance (George et al., 1995). Mutations in the RS1 gene were shown to be causative for XLRS (Sauer et al. 1997) which is characterized by a splitting of the retinal layers (schisis) as well as defects in signal transduction between ...
Translation of the abstract (English)
X-linked juvenile retinoschisis (XLRS) is a degenerative disease of the retina which primarily affects males due to an X-chromosomal recessive mode of inheritance (George et al., 1995). Mutations in the RS1 gene were shown to be causative for XLRS (Sauer et al. 1997) which is characterized by a splitting of the retinal layers (schisis) as well as defects in signal transduction between photoreceptors and bipolar cells (Molday et al. 2012). The protein encoded by RS1, retinoschisin, is specifically expressed and secreted by photoreceptors and bipolar cells in the retina and was found to bind to plasma membranes of these cell types. Membrane anchorage of retinoschisin was shown to be mediated by the retinal Na/K-ATPase (Friedrich et al., 2011), which had been identified as a retinoschisin interacting protein before (Molday et al., 2007).
The molecular pathomechanism of XLRS and a putative involvement of the Na/K-ATPase in XLRS pathogenesis remain elusive. Therefore, aim of this study was to investigate functional consequences and the structural basis of retinoschisin-binding to the Na/K-ATPase.
To this end, the coding sequences for retinoschisin and a pathogenic retinoschisin variant, RS1-C59S, were fused to a Myc-tag and cloned into expression vectors, enabling purification of the recombinant proteins. These purified proteins were then used in further studies addressing the interaction between retinoschisin and the Na/K-ATPase.
The first project aimed to delineate whether retinoschisin influences Na/K-ATPase levels or membrane stability in murine retinal explants of an RS1 knock out (Rs1h-/Y) mouse model or in Hek293 cells heterologously expressing retinal Na/K-ATPase subunits ATP1A3 and ATP1B2. Recombinant retinoschisin had no effect on Na/K-ATPase protein levels in total cell lysates or enriched plasma membrane fractions from both model systems.
A second project assessed the effect of retinoschisin on the active ion pump function of the Na/K-ATPase. Retinoschisin treatment did not affect Na/K-ATPase catalysed (pump function dependent) ATP cleavage or substrate affinities in Rs1h-/Y retinal explants. Neither did it affect ion transport activity of the heterologously expressed human retinal Na/K-ATPase in Xenopus leavis oocytes.
The third project investigated an influence of retinoschisin on Na/K-ATPase mediated signaling. Recombinant retinoschisin, but not RS1-C59S, was shown to reduce the activity of mitogen activated protein kinase (MAPK) signaling constituents c-RAF and ERK1/2 in Rs1h-/Y retinal explants as well as the human retinoblastoma cell line Y-79. MAPK pathway target genes EGR1 and c-FOS were also downregulated upon retinoschisin treatment in both model systems. Further studies on signal regulation by retinoschisin focused on Rs1h-/Y retinal explants as model system. Recombinant retinoschisin, but not C59S, was found to decrease the activity of the non-receptor tyrosine kinase Src, an initial signal transmitter in Na/K-ATPase mediated signaling (Cui and Xie, 2017). Retinoschisin also decreased the activity of Ca2+ signaling marker Camk2, but not activation of PI3K/AKT signaling marker Akt. Immunohistochemistry in murine wildtype retinae showed overlapping signals of the retinoschisin-Na/K-ATPase complex and scaffolding proteins as well as signal transmitters involved in Na/K-ATPase mediated signal transduction.
The next project assessed the effect of retinoschisin on cellular homeostasis. Retinoschisin treatment did not influence cell viability, cell size or proliferation of Y-79 cells. However, retinoschisin but not RS1-C59S treatment lead to decreased apoptotic activity in Y-79 cells and Rs1h-/Y retinal explants: Expression of the pro-apoptotic marker gene BAX was down regulated in both model systems. In Y-79 cells, retinoschisin reduced the activity of apoptosis marker Caspase-3. Rs1h-/Y retinal explants, cultivated in the presence of retinoschisin for one week ex vivo, exhibited significantly decreased photoreceptor degeneration.
The last project focused on the identification of the Na/K-ATPase interaction site to retinoschisin. Retinoschisin binding to nine different Na/K-ATPase isozyme combinations (ATP1A1, ATP1A2, and ATP1A3 in combination with ATP1B1, ATP1B2, or ATP1B3) was tested and revealed that retinoschisin specifically binds to ATP1B2. Applying ATP1B2-ATP1B1 chimera, the interaction site was further narrowed down to the extracellular domain of ATP1B2. Next, bioinformatics analyses identified two putative protein-interaction sites on the extracellular domain of ATP1B2. These two "docking patches" patches on ATP1B2 were each mutated by introducing the respective sequences of ATP1B1. Analysis of retinoschisin binding to ATP1B2 docking-patch mutants revealed a candidate region in docking patch II, in specific the amino acid (aa) T240, putatively involved in retinoschisin binding.
Taken together, this work provides novel insight into initial pathological processes of XLRS and could thus enhance the development of novel therapeutic options for this currently untreatable disease.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 20:20
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