| Lizenz: Creative Commons Namensnennung 4.0 International PDF - Veröffentlichte Version (88MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-368567
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.36856
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 19 März 2018 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Eugen Kerkhoff |
| Tag der Prüfung: | 22 Februar 2018 |
| Institutionen: | Medizin > Lehrstuhl für Neurologie |
| Stichwörter / Keywords: | Spir/FMN, myosin V, Rab11, actin nucleation, vesicle transport, motor protein complexes, crystallization |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 36856 |
Zusammenfassung (Englisch)
The establishment and maintenance of cell polarity constitutes the basis for the morphological and functional diversity of metazoan cells. Intracellular vesicle transport processes mediate the delivery of cell surface receptors, adhesion proteins and other components to the desired locales, in order to define the polarised higher eukaryotic nature of cells. Members of the Rab family of small ...
Zusammenfassung (Englisch)
The establishment and maintenance of cell polarity constitutes the basis for the morphological and functional diversity of metazoan cells. Intracellular vesicle transport processes mediate the delivery of cell surface receptors, adhesion proteins and other components to the desired locales, in order to define the polarised higher eukaryotic nature of cells. Members of the Rab family of small GTPases thereby act as master regulators for the complex network of trafficking routes, as they specifically attach to intracellular membranes and recruit distinct effector proteins, including motor proteins, in order to facilitate directed transport along microtubule networks and actin tracks. The Rab11 GTPase is critical for exocytic and recycling pathways and has been shown before to recruit the processive actin motor protein myosin V (MyoV) to vesicle surfaces to drive specific cellular functions. Furthermore, there is growing evidence for a coupling of actin assembly by actin nucleation and elongation factors, and myosin motor activity in eukaryotic cells. However, the mechanisms for recruitment of actin nucleators and motor proteins to specific membrane compartments remain unclear. By a set of protein interaction studies, this thesis unravelled a direct physical interaction of the Spir actin nucleators and myosin V motors. The interaction was shown to be mediated by the MyoV globular tail domain (GTD) and a newly identified highly conserved sequence motif (GTBM) in the central Spir linker region and the crystal structure of the Spir-2-GTBM:MyoVa-GTD complex was solved. By means of fluorescence microscopy and FLIM-FRET analysis, the Spir/MyoV interaction was observed in living cells at vesicle membranes as well, proving its biological significance. Further, a regulatory mechanism was revealed in which the Spir-2 protein is able to bind to the back-folded, auto-inhibited MyoV protein and targets it from a cytoplasmic state towards vesicle surfaces.
Spir proteins have been shown before to functionally overlap with Rab11 in exocytic and recycling pathways, although a direct Rab11/Spir interaction has never been revealed. The direct interaction of myosin V motors and Spir proteins identified here enables the formation of a tripartite Rab11:MyoV:Spir protein complex at vesicle surfaces in which the MyoV protein acts as a linker between Rab11 and Spir, as was shown by in vitro interaction studies and fluorescence microscopy. The ternary complex architecture would explain how Rab11 vesicles support coordinated F-actin nucleation and myosin force generation for vesicle transport and tethering. Considering the large diversity of MyoV cooperation with Rab family members, the coordinated recruitment of actin nucleators and actin motors to vesicle surfaces could provide a common mechanism to control force generation and motility of vesicles and organelles in different cellular processes.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Zur Gewährleistung der ordentlichen Entwicklung einer Zelle und deren Funktionen, und um deren Überleben zu sichern, ist die Ausbildung und Aufrechterhaltung einer Zellpolarität entscheidend. Diese wird maßgeblich durch eine differentielle Zusammensetzung der Plasmamembran beeinflusst. Für die Bereitstellung bestimmter Zelloberflächen-Rezeptoren, Anheftungsproteine und weiterer ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Zur Gewährleistung der ordentlichen Entwicklung einer Zelle und deren Funktionen, und um deren Überleben zu sichern, ist die Ausbildung und Aufrechterhaltung einer Zellpolarität entscheidend. Diese wird maßgeblich durch eine differentielle Zusammensetzung der Plasmamembran beeinflusst. Für die Bereitstellung bestimmter Zelloberflächen-Rezeptoren, Anheftungsproteine und weiterer Membranbestandteile an den jeweiligen Membranbereichen sind intrazelluläre, Membranvesikel-getriebene Transportprozesse verantwortlich. Die kleinen Rab GTPasen werden als Hauptregulatoren der diversen, miteinander verknüpften Transportwege angesehen. Diese binden spezifisch an intrazelluläre Membranen und rekrutieren anschließend bestimmte Effektorproteine, wie beispielsweise Motorproteine, welche daraufhin den gerichteten Transport entlang von Mikrotubuli-Netzwerken und Aktinfasern umsetzen. Das Rab11 Protein ist hierbei speziell für den nach außen gerichteten, exozytotischen, und den wieder verwendenden, rückführenden Transport wichtig. In vorherigen Studien wurde bereits gezeigt, dass das Rab11 Protein in der Lage ist, das kontinuierlich laufende Aktin-Motorprotein Myosin V (MyoV) an die Vesikeloberfläche zu ziehen um damit bestimmte Zellfunktionen zu regulieren.
Des Weiteren gibt es vermehrt Hinweise darauf, dass an bestimmten Membrankompartimenten der Aufbau von Aktinfasern mittels Aktin-Nukleations- und Aktin-Polymerisierungs-Proteinen mit der Funktion von Motorproteinen verknüpft ist, wobei der genaue Mechanismus bisher unbekannt ist. Mit Hilfe einer Reihe von Protein-Interaktions-Studien gelang es nun hier, eine direkte, unmittelbare Bindung des Aktin-Nukleations-Proteins Spir-2 an das Myosin V Motorprotein aufzudecken. An dieser direkten Bindung ist zum einen die kompakt gefaltete Endstruktur des MyoV Proteins (globular tail domain, GTD) und zum anderen ein hierbei neu entdecktes, hoch konserviertes Sequenzmotiv (globular tail domain binding motif, GTBM) in der Mitte des Spir Proteins beteiligt. Zudem wurde die Kristallstruktur für diesen Proteinkomplex gelöst. Mittels Fluoreszenz-Mikroskopie und FLIM-FRET Untersuchungen konnte die Interaktion von Spir und MyoV Proteinen auch an Membranvesikeln lebender Zellen beobachtet werden, wodurch letztendlich eine biologische Bedeutung dieser Komplexbildung abzuleiten ist. Außerdem wurde eine regulatorische Funktion des Spir-2 Proteins entdeckt, indem es in der Lage ist, an ein in sich gefaltetes und dadurch selbst-inaktiviertes MyoV-Dimer zu binden und es folglich aus dem Zytoplasma an die Oberfläche bestimmter Vesikel zu bringen.
Obwohl eine direkte Bindung von Spir Proteinen an Rab11 GTPasen nie gezeigt wurde, gibt es einen funktionellen Zusammenhang beider Proteine im exozytotischen und rückführenden Transport. Die im Rahmen dieser Arbeit identifizierte direkte Bindung von Myosin V Motorproteinen an Spir Proteine ebnet allerdings den Weg für die Zusammensetzung eines aus drei Komponenten bestehenden Rab11:MyoV:Spir Proteinkomplex direkt an der Vesikeloberfläche. Wie mittels in vitro Interaktions-Studien und Fluoreszenz-Mikroskopie abgeleitet wurde, fungiert das MyoV Protein hierbei als ein verknüpfendes Protein, das die Funktionen von Rab11 und Spir miteinander verbindet. Der Aufbau dieses dreiteiligen Komplexes würde die koordinierte Bildung von Aktinfasern und Myosin-vermittelter Krafterzeugung erklären, die beide über das Rab11 Protein an die Vesikelmembran lokalisiert werden und die letztendlich den Vesikeltransport und die Vesikelanheftung steuern. Bedenkt man die Vielzahl möglicher Interaktionen von MyoV Proteinen und Rab GTPasen für unterschiedliche Zwecke in verschiedenen Bereichen der Zelle, könnte die genau koordinierte Verknüpfung von Aktin-Nukleatoren und Aktin-Motorproteinen an der Vesikeloberfläche einen möglichen generellen Mechanismus der Krafterzeugung an Vesikeln und anderen Zellorganellen darstellen, um folglich deren Bewegung während verschiedener zellulärer Prozesse zu steuern.
Metadaten zuletzt geändert: 25 Nov 2020 20:15
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