In-vitro Untersuchungen zur Freisetzung und Wirkung von transforming growth factor-ß1 aus humanem Dentin

URN to cite this document:: urn:nbn:de:bvb:355-epub-369146
DOI to cite this document:: 10.5283/epub.36914

Bruckner, Niklas

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License: Creative Commons Attribution 4.0
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Date of publication of this fulltext: 13 Apr 2018 10:03

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Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Open Access Type:	Primary Publication
Date:	13 April 2018
Referee:	Prof. Dr. Kerstin Galler
Date of exam:	9 April 2018
Institutions:	Medicine > Lehrstuhl für Zahnerhaltung und Parodontologie
Keywords:	Dentin, autologe Wachstumsfaktoren, regenerative Endodontie, Ultraschallansätze, transforming growth factor- ß1, Revitalisierung, dentale Stammzellen, Spüllösungen
Dewey Decimal Classification:	600 Technology > 610 Medical sciences Medicine
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	36914

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Abstract (German)

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Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Freisetzung des Wachstumsfaktors TGF-β1 aus humanem Dentin sowie mit der Wirkung von Dentinmatrixproteinen auf humane Pulpazellen.

Untersuchungen an Dentinscheiben und einem kliniknahen Wurzelkanalmodell sollten zeigen, ob eine Ultraschallaktivierung der Spüllösungen (EDTA, PBS) die freigesetzte Menge des repräsentativ ausgewählten Wachstumsfaktors TGF- β1 zu erhöhen vermag und ob es möglich ist, diesen auch in einer physiologischen Pufferlösung zu isolieren. Zur Evaluierung der Ergebnisse wurden enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) durchgeführt. In einem zweiten Schritt erfolgte die Kultivierung von humanen Pulpazellen mit verschiedenen Konzentrationen eines Mediums aus EDTA-löslichen Proteinen der Dentinmatrix, sowie anderen Nähr- und Differenzierungsmedien als Kontrollgruppen. Die Analyse von Zellviabilität und Mineralisationsverhalten der Pulpazellen erfolgte mittels MTT-Assay und Alizarinfärbung. Dabei flossen die im ersten Abschnitt gewonnenen Erkenntnisse zur Menge an freigesetztem TGF-β1 in das Studiendesign des zweiten Teils ein, um ein möglichst realitätsnahes Verhalten der Pulpazellen zu gewährleisten.

Es konnte gezeigt werden, dass TGF-β1 nicht nur in zytotoxischem EDTA, sondern auch in einer physiologischen Pufferlösung isoliert werden kann. Dies wurde auch erfoglreich an einem kliniknahen Modell durchgeführt, welches in Aufbau und Zeitansatz einer realen Behandlungssituation nachempfunden war. Die Ultraschallaktivierung konnte dabei in allen Fällen die freigesetzte Menge an Wachstumsfaktoren erhöhen. Humane Pulpazellen wurden durch die Dentinmatrixproteine zur Differenzierung angeregt und zeigten deutliche Mineralisationserscheinungen nach Alizarinfärbung. Dagegen vermochte keines der Kontrollmedien eine Mineralisation zu induzieren, auch nicht rekombinantes TGF-β1, das in deutlich höheren Konzentrationen als im Dentinmatrixmedium eingesetzt wurde.

Diese in-vitro Ergebnisse unterstützen nicht nur die Empfehlungen der Fachgesellschaften ADA und ESE zur Anwendung von EDTA im Rahmen einer Revitalisierungsbehandlung, sie zeigen auch, dass es möglich ist, Wachstumsfaktoren nicht nur im Wurzelkanal freizulegen, sondern diese auch in einer physiologischen Lösung aus jenem zu isolieren. Durch Ultraschallansätze, wie sie bereits in der konventionellen Endodontie eingesetzt werden, kann die freigesetzte Menge an bioaktiven Molekülen effektiv erhöht werden. Die Wirkung der Dentinproteine auf Pulpazellen lässt vermuten, dass die Zusammensetzung der organischen extrazellulären Matrix des Dentins besser zur Differenzierung von dentalen Stammzellen geeignet ist als rekombinante Moleküle oder andere Differenzierungsmedien.

Abschließend lässt sich festhalten, dass die Isolation der im Dentin vorhandenen Wachstumsfaktoren eine einfache, kostengünstige und klinisch realisierbare Option darstellt, um die Behandlungsstrategien der regenerativen Endodontie möglicherweise zu erweitern und zu verbessern. Zukünftige Untersuchungen müssen zeigen, inwiefern die autologen Wachstumsfaktoren im Rahmen von Revitalisierungsverfahren oder Pulpa Tissue Engineering eingesetzt werden könnten.

Translation of the abstract (English)

The aim of this study was to analyze the release of the growth factor TGF-β1 from human dentin and the effect of dentin matrix proteins on human pulp cells.

Studies on dentin discs and a root canal model should show whether ultrasound activation of the irrigation solutions (EDTA, PBS) can increase the amount of the representatively chosen growth factor TGF- β1 and whether it is also possible to isolate it in a physiological buffer solution. To evaluate the results enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) were performed. In a second step, the cultivation of human pulp cells with different concentrations of a medium of EDTA-soluble proteins of the dentin matrix and other nutrient and differentiation media as control groups was performed. Cell viability and mineralization behaviour of pulp cells were analysed by MTT assay and alizarin staining. The findings on the amount of TGF-β1 released in the first section were incorporated into the study design of the second part in order to ensure that the pulp cells behave as realistically as possible.

It could be shown that TGF-β1 can be isolated not only in cytotoxic EDTA, but also in a physiological buffer solution. This was also successfully carried out on a model close to the clinic, which was modelled on a real treatment situation in terms of structure and time approach. Ultrasound activation was able to increase the amount of growth factors released in all cases. Human pulp cells were stimulated to differentiate by the dentin matrix proteins and showed clear signs of mineralization after alizarin staining. In contrast, none of the control media was able to induce mineralization, including recombinant TGF-β1, which was used in significantly higher concentrations than in the dentin matrix medium.

These in-vitro results not only support the recommendations of the endodontic societies ADA and ESE for the application of EDTA in the context of a revitalization treatment, they also show that it is possible not only to uncover growth factors in the root canal, but also to isolate them from it in a physiological solution. The amount of bioactive molecules released can be effectively increased using ultrasonic tips as those already used in conventional endodontics. The effect of dentin proteins on pulp cells suggests that the composition of the organic extracellular matrix of dentin is better suited for differentiation of dental stem cells than recombinant molecules or other differentiation media.

Finally, the isolation of the growth factors present in dentin is a simple, cost-effective and clinically feasible option to potentially expand and improve the treatment strategies of regenerative endodontics. Future investigations will have to show how autologous growth factors could be used in revitalisation procedures or pulp tissue engineering.

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