| License: Creative Commons Attribution 4.0 (9MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-382532
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.38253
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Number of Pages: | 119 |
| Date: | 23 January 2020 |
| Referee: | Prof. Dr. Ralf Wagner |
| Date of exam: | 22 January 2019 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene |
| Keywords: | HIV, vaccine, DNA library, stable cell lines, antibodies |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 500 Natural sciences & mathematics 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 38253 |
Abstract (English)
The numerous immune evasion strategies embodied in the HIV-1 envelope (Env) glycoprotein still represent a daunting challenge in the development of a safe and effective vaccine. Among the most defying of these evasive mechanisms is the tremendous genetic diversity associated with the immunodominance of highly variable regions of Env. Current vaccine design efforts aim to elicit broadly ...
Abstract (English)
The numerous immune evasion strategies embodied in the HIV-1 envelope (Env) glycoprotein still represent a daunting challenge in the development of a safe and effective vaccine. Among the most defying of these evasive mechanisms is the tremendous genetic diversity associated with the immunodominance of highly variable regions of Env. Current vaccine design efforts aim to elicit broadly neutralizing antibodies (bnAbs), some of which are able to neutralize more than 90% of circulating HIV-1 strains. However, a complex co-evolution of virus and humoral immune response considerably impairs the development of bnAbs. To facilitate this process, novel Env immunogens as well as innovative selection technologies for their identification are required.
The first part of this thesis concentrated on the biological engineering of an envelope-based sequential permutation library, specifically focusing on characterization and quality control of the library. Each residue in the external part of Env was substituted by 20 natural amino acids, thus creating a library of 658 sublibraries and approximately 13.000 variants. Simultaneously, the respective constitutively expressing cell lines were generated by stably transfecting every sublibrary into Flp-InTM T-Rex 293 cells with the with the goal to utilize the stable cell line (SCL) library in a mammalian cell display and cell sorting-based screening technology to identify Env variants with improved antigenicity. Comprehensive quality controls of plasmid DNA library and the respective stable cell line library were conducted to assess potential limitations. In-depth analysis of the pDNA revealed deletions of various lengths majorly in the Env region affecting about 48% of the library. However, these deletions occurred only in a small fraction within the sublibraries, thus the actual contaminations amounted to 6-18%, respectively, deeming the library still eligible to work on. Focusing on the CD4 binding site (CD4bs) of Env, diversity and amino acid distribution of the pDNA- and the stable cell line-library was analyzed by Next Generation Sequencing (NGS). Whereas pDNA exhibited an average diversity of 19 amino acids in the sublibraries with a nearly ideal distribution, stable cell lines demonstrated a considerable decrease in diversity by approximately 38%, as well as a highly uneven and random distribution of amino acids. It stood to reason that particularly insufficient integration of Env during the generation of stable cell lines contributed to this substantial loss of diversity, although many other factors (i.e. transfection efficiency of cells and reagents, transfection of individual Env variants, viability of cells, stage of cell cycle, etc.) could not be excluded as potential causes. To prevent the introduction of such a bias into the selection of beneficial Env variants, optimization of stable cell line generation is an essential prerequisite.The second project focused on the identification of improved Env candidates with favorable antigenicity from the stable cell line library. For this purpose, a mammalian cell display and cell sorting-based technology was applied that combines the benefits of i) single integration of Env into a distinct FRT site resulting in the linkage of genotype and phenotype, ii) inducible Env expression to prevent cytotoxicity effects, iii) translational coupling of Env and GFP enabling an indirect normalization for induced Env expression and iv) display on Hek293T cells, thus ensuring native folding and mammalian glycosylation. Using the CD4bs SCL library, twelve Env variants demonstrating increased (gain of binding, GoB) and decreased (loss of binding, LoB) affinity for the bnAb VRC01, respectively, were selected in a single round of cell sorting procedure. Strikingly, none of the detected GoB variants and merely three LoB candidates could be unequivocally validated by means of a FACS-based equilibrium titration. There were grounds for supposition, that limitations in the selection procedure as well as the low amino acid diversity in the SCLs contributed to the discrepancies in the data
Translation of the abstract (German)
Die zahlreichen immunologischen Ausweichstrategien, welche im HIV-1 envelope (Env) Glykoprotein verkörpert sind, stellen für die Entwicklung eines sicheren und effektiven Vakzins weiterhin ein enormes Hindernis dar. Zu den herausfordernsten Ausweichmechanismen zählt die unermessliche genetische Diversität, welche mit der Immundominanz hoch variabler Regionen von Env assoziiert wird. Die ...
Translation of the abstract (German)
Die zahlreichen immunologischen Ausweichstrategien, welche im HIV-1 envelope (Env) Glykoprotein verkörpert sind, stellen für die Entwicklung eines sicheren und effektiven Vakzins weiterhin ein enormes Hindernis dar. Zu den herausfordernsten Ausweichmechanismen zählt die unermessliche genetische Diversität, welche mit der Immundominanz hoch variabler Regionen von Env assoziiert wird. Die derzeitigen Impfstoffansätze zielen darauf hin breitneutralisierende Antikörper (bnAK) hervorzurufen, von denen einige in der Lage sind mehr als 90% der kursierenden HIV-1 Stämme zu neutralisieren. Allerdings wird die Entwicklung von bnAK aufgrund der komplexen Koevolution von Virus und humoraler Immunantwort erheblich beeinträchtigt. Daher bedarf es neuartiger Env Immunogene sowie innovativer Selektionstechnologien für deren Identifikation, um diesen Prozess zu begünstigen.
Der erste Abschnitt dieser Dissertation beschäftigte sich intensiv mit der biologischen Prozesstechnik einer auf Env basierten sequentiellen Permutationsbibliothek, mit besonderem Schwerpunkt auf Charakterisierung und Qualitätskontrolle der Bibliothek. Jede Position des außenliegenden Env-Bereiches wurde durch 20 natürliche Aminosäuren ersetzt, wodurch eine Bibliothek bestehend aus 658 Unterbibliotheken und schätzungsweise 13.000 Varianten hervorgeht. Gleichzeitung wurden jeweils die konstitutiv exprimierenden Zelllinien durch stabile Transfektion jeder Unterbibliothek in Flp-InTM T-Rex 293 Zellen mit dem Ziel hergestellt. Das Ziel bestand darin diese Bibliothek einer Selektionstechnologie beruhend auf einer Zellsortierung zu unterziehen, um Env Varianten mit verbesserter Anigenität zu identifizieren. Sowohl die Plasmid-DNA- (pDNA), als auch die Zelllinien-Bibliothek wurden umfassend auf ihre Qualität kontrolliert. Die eingehende Analyse der pDNA offenbarte Deletionen verschiedenster Länge hauptsächlich in der Env-Region, welche etwa 48% der Bibliothek betreffen. Allerdings traten diese Deletionen nur zu einen kleinen Bruchteil innerhalb der Unterbibliotheken auf, womit die tatsächliche Kontamination jeweils nur zwischen 6-18% lag. Mit dem Schwerpunkt auf die CD4-Bindestelle von Env wurden Diversität und Verteilung der Aminosäuren der pDNA sowie der stabilen Zelllinien mittels Next Generation Sequencing (NGS) ermittelt. Während die pDNA eine durchschnittliche Variabilität von 19 Aminosäuren und eine nahezu ideale Verteilung aufwies, zeigten die stabilen Zelllinien sowohl einen etwa 38%-igen Rückgang der Diversität, als auch eine beträchtliche und zufallsbedingte Ungleichverteilung der Aminosäuren. Es lag nahe, dass insbesonders die unzureichende Integration von Env bei der Herstellung der stabilen Zelllinien zu diesem Variabilitätsverlust beitrugen, obwohl viele weitere Faktoren (z.B. Transfektionseffizienz von Zellen und Reagenzien, Fähigkeit zur Transfektion individueller Env-Varianten, Viabilität von Zellen, Phase im Zellzyklus, etc.) als mögliche Ursachen nicht ausgeschlossen warden können. Um eine derartige Fehlerquelle nicht in den Env-Selektionsprozess nicht einzubringen, muss daher zunächst die Herstellung der stabilen Zelllinien optimiert werden.Das zweite Projekt beruhte auf der Identifikation von verbesserten Env-Kandidaten mit vorteilhaftem Antigenitätsprofil. Zu diesem Zweck wurde eine Selektionstechnlogie angwendet, die auf einer Zellsortierung beruht und folgende Vorteile vereinigt: i) Integration einer einzigen Env Variante in eine definierte FRT-Stelle pro Zelle, was eine Kopplung zwischen Geno- und Phänotyp zur Folge hat, ii) induzierbare Env Expression, um Zytotoxizitätseffekten vorzubeugen, iii) translationale Verknüpfung von GFP und Env zur indirekten Normalisierung auf die induzierte Env Expression und iv) Expression der Env auf Hek293T Zellen, um native Faltung und Säugetierglykosylierung zu gewährleisten. In einem einzelnen Selektionszyklus wurden jeweils 12 Env Varianten mit erhöhter oder verminderter Affinität für den bnAK VRC01 wurden aus der Zelllinien-Bibliothek ausgelesen. Auffallend dabei war, dass keine der Varianten mit erhöhter und nur drei Varianten mit erniedrigter Bindungsfähigkeit mittels FACS-basierter Gleichgewichtstitration eindeutig validiert warden konnten. Es lag der Vermutung nahe, dass sowohl Limitationen innerhalb des Selektionsprozesses, als auch die reduzierte Diversität der Aminosäuren in stablien Zelllinien zu den Unstimmigkeiten der Daten beitrugen
Metadata last modified: 25 Nov 2020 18:45
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