This study conducted in vitro analyses to investigate the splicing effects of twenty ABCA4 variants and one CNGB3, which had been predicted in silico to cause aberrant mRNA splicing. To circumvent the problem of tissue availability, the method of in vitro exon trapping was employed, based on the work of Cepko et al., 55 which capitalizes on the highly conserved sequences flanking splice sites, and implements transmissible expression vectors to generate and recover genomic inserts.56, 57 Following replication and selection in E.coli, the pSPL3b vector containing the construct was transfected in transient cells, the RNA isolated, reverse transcribed, and RT-PCR amplified. Visualizing the products via gel electrophoresis allowed for an initial comparison of splicing activity between the normal allele and mutant variants. Of the twenty-one variant analyses, nine were completed within the allotted timeframe for this medical dissertation. Seven variants (three canonical, two intronic, and two exonic) demonstrated disrupted splicing behaviour in vitro in accordance with in silico predictions.

Diese Studie führte in vitro Analysen durch, um das Spleißverhalten von zwanzig ABCA4Varianten und einer CNGB3-Variante zu untersuchen, bei denen in silico Vorhersagen darauf hindeuteten fehlerhaftes MRNA-Spleißen zu erwarten. Um das Problem der Gewebeverfügbarkeit zu umgehen, wurde die sogenannte in-vitro-Exon-Trapping-Methode angewandt, welche sich auf die Arbeit von Cepko et al. 55 bezieht und die hochkonservierten Sequenzen, die die Spleißstellen flankieren, zu Nutze macht. Übertragende Expressionsvektoren wurden eingesetzt, um genomische Inserts zu erzeugen bzw. wiederzugewinnen. Nach der Replikation und Selektion in E. coli wurde der pSPL3b-Vektor mit dem eingeschlossenen Konstrukt in transienten Zellen transfiziert, die RNA isoliert, revers transkribiert und RT-PCR amplifiziert. Die Visualisierung der Produkte mittels Gelelektrophorese ermöglichte einen ersten Vergleich des Spleißverhaltens zwischen den gesunden und mutierten Varianten. Von den insgesamt 21 untersuchten Varianten wurden neun innerhalb des zugewiesenen Zeitrahmens dieser Dissertation abgeschlossen. Sieben davon (drei kanonische, zwei intronische, sowie zwei exonische) zeigten in Übereinstimmung mit den in silico-Vorhersagen ein gestörtes Spleißverhalten in vitro.