| License: Publishing license for publications excluding print on demand (5MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-434377
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.43437
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | January 2021 |
| Referee: | Prof. Dr. Anja Katrin Wege |
| Date of exam: | 3 July 2020 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Frauenheilkunde und Geburtshilfe (Schwerpunkt Frauenheilkunde) |
| Keywords: | breast cancer, Luminal, (humanized) tumor mouse |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 500 Natural sciences & mathematics 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 43437 |
Abstract (English)
The breast cancer subtype Luminal B is diagnosed in 20% of all breast cancer cases whereas only 50 % of the patients are still alive 5 years after the first diagnosis. Despite the advances in treatment, patients suffering from Luminal B breast cancer frequently experience a relapse or develop distant metastases. Besides the current strategy of hormone-receptor-positivity, proliferation indices, ...
Abstract (English)
The breast cancer subtype Luminal B is diagnosed in 20% of all breast cancer cases whereas only 50 % of the patients are still alive 5 years after the first diagnosis. Despite the advances in treatment, patients suffering from Luminal B breast cancer frequently experience a relapse or develop distant metastases. Besides the current strategy of hormone-receptor-positivity, proliferation indices, grading, and gene signature assays to categorize the Luminal breast cancer patients into high and low-risk groups, there is still a lack of appropriate markers that reliably predict events of recurrence. Overall, this thesis aims to identify biomarkers that are associated with aggressivity, cell dissemination and/or metastases formation. Importantly these markers might contribute to the therapy decision if Luminal B breast cancer patients need a chemotherapeutic intervention or not.
Therefore, the primary Luminal B patient samples were analyzed and PDX models were generated by the transplantation of primary Luminal B patient samples into NSG mice, the so-called tumor mouse (TM). Additionally, humanized Luminal B tumor mice (HTM) were generated and assessed under the influence of the human immune system. The phenotypic analysis of the primary patient samples revealed that a high expression of CD24 in Luminal B breast cancer patients differs from Luminal A breast cancer patients. The occurrence of MICs (CD44+/cMET+/CD47+) in the high-risk Luminal B tumors (patients that died, suffered from a relapse, or when the PDX model was successful) compared with low-risk Luminal B tumors (patients that are alive, without a relapse, and where the PDX model failed) could serve as a marker for the identification of high-risk Luminal B breast cancer patients. Remarkably, tumor cells of lung metastases differed phenotypically to those of the primary tumor, showing an increased CD44 and cMET expression in the TM, as well as in the patient metastases (e.g. pleural effusion and ascites). Enhanced expression of cMET and CD44 in Luminal B metastases were determined to be independent of the absence or the presence of a human immune system. Moreover, an increased CD4/CD8 ratio was determined as an indicator of a high-risk Luminal B tumor. However, the most important finding was the dependence of MDM2 amplification to form highly aggressive tumors accompanied by the high probability for metastatic spread in Luminal B TM and HTM. When MDM2 was amplified in tumors, the metastases preferentially were found in the lung of the PDX model, and DTCs in the bone marrow. This means that an amplification of MDM2 in Luminal breast cancer characterizes the patients as high-risk patients. These findings were confirmed in vitro by a MDM2 knockdown experiment, showing a p53 mediated mechanism of apoptosis and cell proliferation. Targeting MDM2 by AMG232 inhibition revealed increased apoptosis and reduced proliferation, which demonstrated the potential clinical relevance. TP53 mutation was also detected as a high-risk marker in Luminal B TM as this alteration in the primary tumor promoted BM DTCs. MDM4 amplification was verified to promote metastatic spread into various organs, such as the lung, the liver, the brain, and the BM, and subclassifies the tumor as a high-risk tumor. All the determined genomic alterations of MDM2, p53, and MDM4 regulate each other, which shows the importance of the pathway for high-risk Luminal B breast cancer.
Single cell sequencing revealed one cluster formation of primary tumor with specific genomic losses and gains and another cluster mainly formed by DTCs. The differences in copy number profiles were preferentially shown by DTCs that derived from HTM PDX but not from TM, implicating a selection pressure in the periphery potentially evoked by human immune cells. Moreover, a selection determined by the bone marrow niche, which is altered by human immune cells in the HTM, could enable DTCs with a special genetic profile to colonize. The low immunogenicity of Luminal B tumors was demonstrated in primary patient samples and in the HTM, rendering the Luminal B HTM PDX as an adequate model to analyze Luminal B breast cancer. These models could be useful for preclinical immune-modulatory studies in Luminal B breast cancer in the future.
In summary, we showed the suitability of Luminal B PDX and humanized PDX models that are able to identify geno- and phenotypic markers that predict a high potential for metastatic spread and aggressiveness of the tumor. However, prospectively further studies on MDM2 amplification and MDM2 expression in Luminal B breast cancer have to be validated in large patient cohorts. Further clinical studies should determine if breast cancer patients with genetic MDM2/MDM4/TP53 predisposition might additionally benefit from cytotoxic intervention or from specific MDM2 targeting (e.g., by MDM2 inhibitors).
Translation of the abstract (German)
Luminal B Brustkrebs tritt bei 20 % aller diagnostizierten Mammakarzinome auf. Jedoch haben Patientinnen bei dieser Diagnose nur eine 50 prozentige Überlebenswahrscheinlichkeit für die nächsten 5 Jahre. Hierbei zählt vor allem ein Rückfall oder die spätere Metastasierung nach wie vor zu den häufigsten Todesursachen, auch wenn es zwischenzeitlich einige Fortschritte in deren Behandlung gibt. ...
Translation of the abstract (German)
Luminal B Brustkrebs tritt bei 20 % aller diagnostizierten Mammakarzinome auf. Jedoch haben Patientinnen bei dieser Diagnose nur eine 50 prozentige Überlebenswahrscheinlichkeit für die nächsten 5 Jahre. Hierbei zählt vor allem ein Rückfall oder die spätere Metastasierung nach wie vor zu den häufigsten Todesursachen, auch wenn es zwischenzeitlich einige Fortschritte in deren Behandlung gibt. Dennoch stellt vor allem die Risikoeinschätzung, die ein potentielles Rezidiv und/oder die Manifestierung von Fernmetastasen vorhersagt, ein Problem dar. Die gängigen Marker die hierzu verwendet werden, wie der Hormonrezeptor Status, die Proliferationsindizes, die Zelldifferenzierung und genetischen „Assays“ reichen nicht aus, um Luminal B Patientinnen in „Hoch und „Niedrig-Risikogruppen“ einzuteilen. Deshalb war die Zielsetzung dieses Projekts Marker zu identifizieren, die eine Einteilung der hoch aggressiven Luminal B Tumoren ermöglichen und Tumorzelldisseminierung und Metastasierung vorhersagen. Diese sollen es erleichtern eine Therapieentscheidung zu treffen und zusätzlich die Frage beantworten, ob eine Luminal B Brustkrebspatientin Chemotherapie benötigt oder nicht.
Um diese Fragen zu beantworten, wurden die Primärtumore der Luminal B Patientinnen phänotypisch untersucht. Gleichzeitig wurden aus den Primärtumoren sogenannte Luminal B Xenotransplantations-Modelle generiert (Tumormäuse TM) und analysiert. Zudem sollte auch der Einfluss des humanen Immunsystems auf Luminal B Tumoren analysiert werden, was durch das Generieren der humanisierten Tumormäuse (HTM) ermöglicht wurde. Phänotypisch zeigte sich, dass man Luminal B Tumoren anhand der erhöhten CD24 Expression im Vergleich zu Luminal A ermitteln kann. Zudem zeigte sich bei den primären Luminal B Hoch-Risikotumoren (definiert durch Todesfall der Patientin, Rückfall oder Metastasierung, und durch das Anwachsen eines Luminal B Tumors als Xenotransplantations-Model) ein erhöhtes Vorkommen der Co-expression von CD44/cMET/CD47 der sogenannten Metastasierungs-initiierenden Zellpopulation im Vergleich zu Luminal B Niedrig-Risikotumoren (alle Patientinnen, die überlebt haben; keinen Rückfall erlitten und bei welchen der Tumor nicht im Xenograftmodel angewachsen ist). Zusätzlich konnte beim phänotypischen Vergleich von Luminal B Primärtumoren und der zugehörigen Metastase eine erhöhte Expression von cMET und CD44 nachgewiesen werden. Dies zeigte sich sowohl beim Vergleich von TM oder HTM Tumoren mit der dazugehörigen Lungenmetastase, als auch bei den Primärtumoren der Patientinnen die mit Luminal B Aszites Präparaten oder Pleuraergüssen verglichen wurden. Es konnte auch ein erhöhtes CD4/CD8 Verhältnis auf Immunzellen, die den Tumor infiltrieren, in Luminal B Hoch-Risikotumoren nachgewiesen werden. Eine der wichtigsten Entdeckungen dieser Arbeit stellte dabei das vermehrte Auftreten einer MDM2 Amplifikation in Luminalen Tumoren dar. Diese zeigte sich mit erhöhter Tumoraggressivität und einer hohen Metastasierungswahrscheinlichkeit in Luminal B TM und HTM. In TM und HTM wiesen MDM2 amplifizierte Tumore zudem häufig Lungenmetastasen und disseminierte Zellen im Knochenmark auf. Diese Ergebnisse wurden in Zellkulturversuchen durch eine Herunterregulierung von MDM2 validiert und zeigten dabei einen p53 abhängigen Mechanismus, der die Proliferation und Apoptose der Tumorzellen steuert. Im Einklang mit diesen Ergebnissen stand auch die Behandlung der Zellen mit einem MDM2 Inhibitor (AMG232) und liefert dadurch einen klinisch relevanten Ansatz zur Therapie von MDM2 amplifizierten Tumoren. Zudem wurden genetische TP53 Mutationen in Luminal B Tumoren mit erhöhter Disseminierung von Tumorzellen ins Knochenmark in Verbindung gebracht. Die Amplifikation von MDM4 in Luminal B Tumoren zeigte in der TM hingegen sogar eine Metastasierung des Tumors in multiple Organe wie der Lunge, der Leber, des Gehirns, und des Knochenmarks. Interessanterweise regulieren sich alle entdeckten genomischen Aberrationen (MDM2/P53/MDM4) gegenseitig und gehören zum gleichen Signalweg. Das wiederum deutet auf eine wichtige Rolle von MDM2, p53 und MDM4 beim aggressiven Luminal B Mammakarzinom hin. Auffallend hierbei sind nicht nur die Aggressivität der Tumore, sondern auch die aberrationsabhängige Metastasierung in bestimmte Organe. Ein weiterer Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit den genetischen Unterschieden zwischen Einzelzellen aus dem Primärtumor und disseminierten Tumorzellen im Knochenmark in der TM und HTM. Hierbei konnte gezeigt werden, dass die Tumorzellen aus dem Primärtumor (TM und HTM) und die disseminierten Tumorzellen aus dem Knochenmark unterschiedliche Cluster bilden und damit unterschiedliche genetische Modifikationen aufweisen. Interessanterweise differenzierten sich zudem disseminierte Tumorzellen aus dem Knochenmark von HTM von allen anderen Tumorzellen und auch den disseminierten Zellen aus der TM. Dies deutet auf einen möglichen Selektionsdruck auf Zellen mit bestimmter genetischer Ausstattung hin, der in der Peripherie von humanen Immunzellen verursacht wird. Zudem kann dies aber auch auf Knochenmarksnischen-bedingte Selektion, die durch humane Immunzellen verändert wird, zurückgeführt werden. Insgesamt zeigte sich in diesen Experimenten die generell geringe Immunogenität von Luminal B Tumoren sowohl auf Patientenebene als auch in der HTM. Somit spiegelt das HTM Xenotransplantations-Modell die Situation im Luminal B Patienten erfolgreich wider und ist damit auch ein Modell für zukünftige Therapiestudien für dieses Patientenkollektiv.
Zusammenfassend zeigte sich, dass Luminal B Xenotransplantations-Modelle und humanisierte Luminal B Xenotransplantations-Modelle ein geeignetes System zur Identifizierung von phäno- und genotypischen Veränderungen sind, die mit einem erhöhten Metastasierungspotential und einer erhöhten Aggressivität einhergehen. Zurzeit werden MDM2 Amplifikationen und Expressionen im Zusammenhang mit dem (tumorfreien) Überleben an einem größeren Patientenkollektiv in unserem Labor untersucht. Weitere klinische Studien könnten dann zeigen, ob Luminal B Brustkrebspatientinnen mit Tumoren, die eine MDM2/MDM4/TP53 Veränderungen aufweisen, zusätzlich von einer Chemotherapie oder eventuell von einer zielgerichteten Inhibition von MDM2 profitieren würden.
Metadata last modified: 11 Jan 2021 07:52
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