| Lizenz: Creative Commons Namensnennung 4.0 International Dissertation LMD (4MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-442315
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.44231
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 1 Juni 2022 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Bernhard H. F. Weber |
| Tag der Prüfung: | 22 September 2020 |
| Institutionen: | Medizin > Lehrstuhl für Humangenetik |
| Stichwörter / Keywords: | Bestrophin-1, Morbus Best, Wirkstoffscreening |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 500 Naturwissenschaften 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 44231 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Humanes Bestrophin-1 (BEST1) ist ein Chloridkanal, der in der basolateralen Membran des retinalen Pigmentepithels lokalisiert ist. Dieser Kanal wird durch Veränderungen der Kalziumkonzentration und des Zellvolumens reguliert. Genetische Veränderungen in dem dafür kodierenden Gen (BEST1) können zu degenerativen Netzhauterkrankungen führen, wobei sich mehrere distinkte Krankheitsbilder, wie Morbus ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Humanes Bestrophin-1 (BEST1) ist ein Chloridkanal, der in der basolateralen Membran des retinalen Pigmentepithels lokalisiert ist. Dieser Kanal wird durch Veränderungen der Kalziumkonzentration und des Zellvolumens reguliert. Genetische Veränderungen in dem dafür kodierenden Gen (BEST1) können zu degenerativen Netzhauterkrankungen führen, wobei sich mehrere distinkte Krankheitsbilder, wie Morbus Best (M. Best), auch bekannt als Best’sche vitelliforme Makuladystrophie (BVMD) sowie die autosomal-dominante vitelliforme Makuladystrophie (AVMD), die autosomal-dominante Vitreoretinochoroidopathie (ADVIRC) und die autosomal-rezessive Bestrophinopathie (ARB) unterscheiden lassen. Bis heute steht für keine dieser Erkrankungen eine Therapie zur Verfügung. Die vorliegende Arbeit hat zum Ziel, Hochdurchsatz-geeignete Screening-Plattformen für die Suche nach BEST1-Modulatoren zu entwickeln, welche die Funktion des mutanten BEST1 wiederherstellen und sich somit potentiell zur M. Best-Therapie eignen.
Initiale Aufgabe war es, belastbare BEST1-exprimierende Zellkulturmodelle zu generieren. Eine stabile transgene BEST1-Expression, wildtypisch und mutant, wurde im polaren Madin Darby Canine Kidney II (MDCKII)-Zellsystem erreicht. Zusätzlich wurde ein Patienten-abgeleitetes Zellmodell von retinalen Pigmentepithelzellen (hiRPE) aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) generiert.
Ein Zellkulturrepositorium wurde für fünf patientenabgeleitete Zelllinien mit nachgewiesenen pathologischen Mutationen im BEST1 etabliert und phänotypisch charakterisiert. Dabei wurden klare und robuste Unterschiede zwischen wildtypischem und mutantem BEST1 bezüglich Lokalisation und Kanalfunktion festgestellt. Immunozytochemische Färbungen zeigten eine klare Fehllokalisation einiger M. Best-assoziierter BEST1-Varianten in hiRPE- und MDCKII-Zelllinien. Außerdem wurde bei allen BEST1-Mutationen anhand eines Biosensor-basierten Halogenidtransport-Assays eine eindeutige Beeinträchtigung der Kanalfunktion beobachtet. Die verringerte Anionenleitfähigkeit des mutierten BEST1 wurde mittels eigens im Rahmen dieser Arbeit am Institut etablierten Patch-Clamp-Systems in Whole-Cell-Messungen bestätigt.
Die Detektion der BEST1-Lokalisation (Lokalisations-Assay) und die Messung der BEST1-Kanalfunktion (Halogenidtransport-Assay) konnten als Messparameter für Hochdurchsatz-Screenings (HTS) im 384- bzw. 96-Well-Format genutzt werden. Somit konnten Roboterautomation-gestützte Pipelines etabliert und die Wirksamkeit von jeweils ca. 2.500 Wirkstoffen getestet werden.
Durch den Lokalisations-Assay wurden 72 Wirkstoffe als Treffer im primären Screen detektiert, wobei 37 Wirkstoffe tatsächlich zur Korrektur der Lokalisation des mutierten BEST1 führten. Durch den Halogenidtransport-Assay wurden 98 Treffer im initialen Screening detektiert. In den weiteren Screening-Schritten wurde der Wirkstoff mit dem Codenamen „The Secret Ingredient“ (SeIng) als vielversprechender Potentiator aufgedeckt, der die BEST1-Kanalfunktion des mutanten BEST1 wiederherstellte. Dessen positiver Effekt auf die Anionenpermeabilität zeigte sich als robust replizierbar, spezifisch, konzentrationsabhängig und stabil für mehrere unterschiedliche pathogene BEST1-Varianten. Die Wirksamkeit von SeIng wurde auch durch direkte Anionenstrom-Messungen am Patch-Clamp-System in hiRPE verifiziert.
In der vorliegenden Arbeit wurden in Zellkulturmodellen klare phänotypische Unterschiede bzgl. Lokalisation und Kanalfunktion zwischen normalem BEST1 und M. Best-assoziierten BEST1-Mutanten detektiert. Um nach Korrektoren der Lokalisation und Potentiatoren der Kanalfunktion des mutierten BEST1 zu suchen, wurde die Detektion dieser Merkmale auf HTS-geeignete Formate übertragen. Durch die beiden neu entwickelten Screening-Plattformen war es ermöglich, potentiell therapeutisch einsetzbare BEST1-Modulatoren zu identifizieren.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Human Bestrophin-1 (BEST1) is a chloride channel localized at the basolateral membrane of the retinal pigment epithelium (RPE) which can be triggered via fluctuations in calcium levels and cell volume. Mutations in the protein-coding gene BEST1 result in degenerative retinal diseases whereby several distinct clinical phenotypes can be distinguished such as Best disease (BD), also known as Best ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Human Bestrophin-1 (BEST1) is a chloride channel localized at the basolateral membrane of the retinal pigment epithelium (RPE) which can be triggered via fluctuations in calcium levels and cell volume. Mutations in the protein-coding gene BEST1 result in degenerative retinal diseases whereby several distinct clinical phenotypes can be distinguished such as Best disease (BD), also known as Best vitelliform macular dystrophy (BVMD) as well as the autosomal dominant vitelliform macular dystrophy (AVMD), the autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC) and the autosomal recessive bestrophinopathy (ARB). Today, no therapy is available to treat these disorders. The efforts of this study are directed towards developing high-throughput drug screening platforms to search for BEST1 modulators, which restore mutant BEST1 function with the potency to treat BD.
The initial task was to generate robust BEST1 expressing cell culture models. Stable transgenic wildtype and mutant BEST1 expression was achieved in the polar Madin Darby Canine Kidney II (MDCKII) cell system. In addition, a patient-derived cell model of retinal pigment epithelial cells (hiRPE) was generated from human induced pluripotent stem cells (hiPSC).
A cell culture repository was established and phenotypically characterized for five patient-derived cell lines with confirmed pathological BEST1 mutations. Clear and robust differences in localization and channel function between wildtype and mutant BEST1 were detected. Immunocytochemical staining demonstrated a clear mislocalization of some M. Best-associated BEST1 variants in hiRPE and MDCKII cell lines. A biosensor-based halide transport assay revealed diminished channel function in all BEST1 mutants. The reduced anion permeability of the mutated BEST1 was further confirmed in whole-cell patch-clamp recordings, especially established as part of this work at the institute.
The detection of BEST1 localization (localization assay) and the measurement of BEST1 channel function (halide transport assay) could be transferred as measuring parameters in high-throughput screenings (HTS) in 384- or 96-well formats. This enabled the establishment of robotic process automation pipelines and the performance of drug screenings of approximately 2,500 active substances.
The localization assay detected 72 hits in the primary screen with 37 active substances actually leading to the correction of mutant BEST1 localization. The halide transport assay detected 98 hits in its initial screening. In additional screening steps, the compound with the code name "The Secret Ingredient" (SeIng) was identified as a promising potentiator that restored mutant BEST1 channel function. Its positive effect on anion permeability was confirmed to be replicable, specific, concentration-dependent and stable for several different pathogenic BEST1 variants. The efficacy of SeIng was verified by direct anion current measurements via patch-clamp recordings in hiRPE.
The present study demonstrates clear phenotypic differences regarding localization and channel function between normal BEST1 and M. Best-associated BEST1 mutants in cell culture models. In order to search for correctors for mutant BEST1 localization and potentiators to restore mutant BEST1 channel function, the detection of these features was transferred to formats suitable for HTS. The two newly generated screening platforms enabled the identification of BEST1 modulators for potential future M. Best therapy.
Metadaten zuletzt geändert: 01 Jun 2022 05:37
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