| License: Creative Commons Attribution 4.0 (13MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-444045
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.44404
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 10 January 2022 |
| Referee: | Prof. Dr. Bernhard Weber and PD Dr. habil. Caroline Brandl |
| Date of exam: | 18 December 2020 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Humangenetik |
| Keywords: | CRISPR-Cas9, Genom-Editierung, genome editing, Haplotyp, haplotype, DNA-cleavage, gene knock-out, Gen Knock-Out, gene therapy, Gentherapie, Morbus Best, Best'sche vitelliforme Makuladystrophie, vitelliform macular dystrophy, Erbkrankheit, hereditary disease |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 500 Natural sciences & mathematics 500 Science > 570 Life sciences 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 44404 |
Abstract (German)
Bestrophin-1 (BEST1) ist ein integrales Membranprotein, das sich beim Menschen ausschließlich an der basolateralen Membran des retinalen Pigmentepithels (RPE) befindet. Das Protein setzt sich aus fünf identischen Untereinheiten zusammen und fungiert als Volumen-gesteuerter Kalzium-abhängiger Chlorid-Kanal. Bislang wurden über 200 Mutationen im BEST1-Gen entdeckt, die mit verschiedenen ...
Abstract (German)
Bestrophin-1 (BEST1) ist ein integrales Membranprotein, das sich beim Menschen ausschließlich an der basolateralen Membran des retinalen Pigmentepithels (RPE) befindet. Das Protein setzt sich aus fünf identischen Untereinheiten zusammen und fungiert als Volumen-gesteuerter Kalzium-abhängiger Chlorid-Kanal. Bislang wurden über 200 Mutationen im BEST1-Gen entdeckt, die mit verschiedenen hereditären Augenerkrankungen, den sogenannten Bestrophinopathien, assoziiert sind. Hierbei stellt die autosomal dominante juvenile Best’sche vitelliforme Makuladystrophie (BVMD) die häufigste Form dar. Im Krankheitsverlauf führt dabei eine Ansammlung von Lipofuszin im RPE allmählich zur atrophischen Vernarbung des RPE und bewirkt einen progredienten Sehverlust. Da der genaue Pathomechanismus der Erkrankung bislang noch ungeklärt ist, lassen sich gegenwärtig auch keine möglichen Therapie- optionen ableiten. Die Mutationen im BEST1-Gen lassen bei heterozygotem Vorliegen auf einen dominant-negativen Effekt auf die Funktion des homo-pentameren Kanals schließen. Bereits eine einzige defekte Proteinuntereinheit führt dabei vermutlich zu einer beeinträchtigten Kanalfunktionalität. Somit erscheint es zur Steigerung der Kanalfunktionalität therapeutisch als sinnvoll, jenes mutierte Allel gezielt auszuschalten, das zur Transkription defekter Proteine führt. Dadurch wäre die Proteinexpression zugunsten des wildtypischen Allels verschoben und die Oligomerisierung des Kanals könnte vermehrt aus intakten Proteinuntereinheiten erfolgen. Eine vielversprechende Methode für eine derartige Genveränderung basiert auf dem CRISPR/Cas9-System. Dieses System nutzt eine Cas9-Nuklease, die mithilfe einer Sequenz-spezifischen sgRNA zu einer bestimmten Ziel-DNA navigiert wird und dort einen Doppelstrangbruch auslöst.
Diese Arbeit verfolgte das Ziel, mittels CRISPR-Cas9 einen Knock-Out des pathologischen BEST1-Allels durch spezifische Deletion des Mutations-tragenden Haplotypen herbeizuführen. Für diesen Mutations-unabhängigen Ansatz sollte ein minimales Set an spezifischen sgRNAs entworfen werden, das ein Ausschalten der häufigsten BVMD-assoziierten Haplotypen der europäischen Bevölkerung ermöglicht. Eine derartige Haplotypendeletion kann unter Zuhilfenahme häufiger genomischer Polymorphismen (SNPs) der europäischen Population erreicht werden, indem zwei SNP-spezifische sgRNAs zwei heterozygote SNPs in cis-Lage zur Mutation binden und so das Schneiden der DNA durch die Cas9-Nuklease ermöglichen. Auf diese Weise können Exon-überspannende Doppelstrangbrüche in der mutierten DNA- Sequenz und vorzeitige Stopp-Codons erzeugt werden, die konsekutiv in einem Knock-Out des mutierten BEST1-Gens resultieren.
Im Rahmen dieser Arbeit erfolgte hierzu die Identifikation der häufigsten europäischen Haplotypen und eine anschließende Zuordnung der Patientenkohorte. Diese Haplotypen wurden auf Grundlage von 22 SNPs mit einer Häufigkeit >5% im BEST1- Genlocus generiert. Als nächstes wurden zur Durchführung der Haplotyp-spezifischen Deletion geeignete SNPs ausgewählt und SNP-spezifische sgRNAs bioinformatisch ermittelt und hergestellt. Diese sgRNAs wurden im Anschluss in HEK293T-Zell- Transfektionen auf ihre Effizienzen und Spezifitäten hin untersucht, Allel-spezifische Doppelstrangbrüche in der Ziel-DNA zu induzieren. Die Transfektionsergebnisse zeigten allerdings, dass sich die bioinformatischen Berechnungen für scheinbar hohe Effizienz- und Spezifitätsegenschaften der sgRNAs experimentell nicht immer bestätigen ließen und somit auch potentielle genomweite off-target-Ereignisse nicht zuverlässig vorhergesagt werden können. In einem finalen Schritt wurde versucht, die sgRNAs durch verschiedenste Sequenzmodifikationen, wie Sequenzverkürzungen oder eingefügte Nukleotidvariationen, in ihren Spezifitäten gegenüber der Ziel-DNA zu verbessern. Nach Abschluss des Optimierungsprozesses konnten für alle sgRNAs erhöhte Spezifitäten beobachtet werden. Erwähnenswerter Weise führten dabei jeweils Zielsequenz-abhängig unterschiedliche Sequenzmodifizierungen zum spezifischsten Transfektionsergebnis einer sgRNA, weshalb keine allgemein gültige Aussage über die Optimierungsstrategien von sgRNAs getroffen werden konnte. Nach erfolgreicher Spezifizierung der sgRNAs und Reduktion genomweiter off-target- Sequenzen könnte der Haplotyp-spezifische Ansatz durchaus eine sinnvolle Strategie für das Ausschalten krankhafter Transkripte am Genort der BVMD sein. Bereits mit etwa 10-15 SNPs könnte ein Großteil der europäischen Patientenpopulation „behandelt“ werden, ohne jede der über 200 möglichen BVMD-Mutationen gesondert ausschalten zu müssen. Langfristig müsste jedoch erst das Ausmaß der tatsächlich stattgefundenen Haplotypendeletion in von Patienten abstammenden Zelllinien erfasst werden, das mit Hilfe der in dieser Arbeit detektierten SNPs und entwickelten sgRNAs erzielt werden konnte. Die Tolerierung einer daraus resultierenden Haploinsuffizienz und eine zu erwartende Wiederherstellung der BEST1-Kanalfunktionalität müsste aber letztendlich noch in differenzierten RPE-Zellen aus CRISPR/Cas9-behandelten Patienten-Stammzellen mit funktionellen Analysen in vitro bestätigt werden.
Translation of the abstract (English)
Bestrophin-1 (Best1) is one of four paralogous genes of the human bestrophin family and encodes an integral membrane protein, highly expressed at the basolateral membrane of the retinal pigment epithelium (RPE). The protein is composed of five identical subunits forming a homo-pentameric volume-regulated anion channel. Until now, more than 200 independent pathologic mutations in the Best1 gene ...
Translation of the abstract (English)
Bestrophin-1 (Best1) is one of four paralogous genes of the human bestrophin family and encodes an integral membrane protein, highly expressed at the basolateral membrane of the retinal pigment epithelium (RPE). The protein is composed of five identical subunits forming a homo-pentameric volume-regulated anion channel. Until now, more than 200 independent pathologic mutations in the Best1 gene have been associated with the formation of at least four distinct hereditary retinopathies, collectively called the bestrophinopathies. The best vitelliform macular dystrophy (BVMD) is inherited in an autosomal dominant way and occurs with greatest majority amongst all bestrophinopathies. BVMD is characterized by a subretinal accumulation of lipofuszin and fluid leading to retinal atrophy and progressive vision loss. To date, there is no treatment for any of the bestrophinopathies but clinical trials are underway to determine efficacy of gene therapy.
Heterozygous mutations in the Best1 gene seem to act in a dominant negative way on wildtype protein function. Incorporation of a single mutant Best1 subunit into the pentameric channel already leads to impaired protein functionality. Allele-specific silencing of the mutant Best1 gene while leaving the wildtype allele intact consecutively could be a promising therapeutic approach to restore channel functionality. Such an approach could be feasible with the help of CRISPR/Cas9, which directly permits to abolish mutant mRNA and consequently protein expression. The CRISPR/Cas9 system allows to target and cleave any genomic target site via a sequence-specific guide RNA (sgRNA) and a Cas9 nuclease.
This study proposed to explore a novel therapeutic approach to treat the dominant-negative BVMD by eliminating common European haplotypes carrying the Best1 mutation. For this mutation-independent approach it was necessary to engineer a set of highly specific sgRNAs mediating the haplotype-associated knock-out. The deletion of pathologic haplotypes can be achieved by targeting two heterozygous single nucleotide polymorphisms (SNPs) in cis-localization to the mutation. An important step of this study was to identify frequent SNPs and haplotypes of the European population and assign them to the patient cohort of this study. The haplotypes have been generated based on a selection of 22 SNPs with a frequency > 5% within the Europeans. Afterwards sgRNAs have been computationally engineered and constructed for a selection of SNPs. The transfection of HEK293T-cells with sgRNA-nuclease-complexes gave insight into the specificity and efficacy of each constructed sgRNA to induce double strand breaks within the target DNA. First results partially showed low credibility of web-based tools, predicting the specificity and efficacy of some of the investigated sgRNAs, while experimentally collected data in this study often showed contrary outcomes. Therefore, off-target events cannot always be forecasted with high precision and genome wide detection of DNA cleavage is always required after gene editing by CRISPR/Cas9 has been performed. In a final step all initially constructed sgRNAs underwent a process of optimization in which either truncations or nucleotid variations have been applied. It is worth mentioning that the transfection results, using the modified sgRNAs, varied broadly depending on the modification strategy and nucleotide sequence of the target DNA, but optimization of specificity could be achieved in all cases.
In conclusion, the haplotype-specific knock-out of mutant Best1 could be an innovative therapeutic approach to address patients carrying genomic variants causing BVMD. Compared to targeting over 200 disease causing mutations one by one by CRISPR/Cas9, the deletion of the most common haplotypes amongst Europeans associated with the mutation could already be accomplished by a small set of 10-15 sgRNAs. The amount of successfully deleted haplotypes, harboring heterozygous mutations in Best1, further needs to be evaluated in a following study using patient-derived cells. Subsequently, it has to be determined in hiPSC-derived RPE wheather haploinsufficiency is tolerated and channel functionality can fully or partially be restored.
Metadata last modified: 10 Jan 2022 07:56
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