| License: Creative Commons Attribution 4.0 (10MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-452015
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.45201
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 1 March 2022 |
| Referee: | Prof. Dr. Christoph Klein |
| Date of exam: | 1 March 2021 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für experimentelle Medizin und Therapieverfahren |
| Keywords: | Metastasierung, Disseminierende Krebszellen, Stammbaumanalyse |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 500 Natural sciences & mathematics 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 45201 |
Abstract (English)
A recent study on metastatic seeding in melanomas showed that lymphatic dissemination occurs very early. Disseminated cancer cells (DCCs) of melanoma patients can leave the primary tumor (PT) in a genomically immature state, then evolve within the lymph nodes (LNs) and adapt to the ectopic site until they start to proliferate and form metastasis. Since the PT and the metastasis are often ...
Abstract (English)
A recent study on metastatic seeding in melanomas showed that lymphatic dissemination occurs very early. Disseminated cancer cells (DCCs) of melanoma patients can leave the primary tumor (PT) in a genomically immature state, then evolve within the lymph nodes (LNs) and adapt to the ectopic site until they start to proliferate and form metastasis. Since the PT and the metastasis are often genetically disparate, the focus for treating metastases should be on the DCCs. The molecular characterization of the DCCs that left the PT at an early stage could reveal new therapeutic targets against metastasis. After routine LN removal in melanoma patients, staining of LNs against the tumour marker MCSP identified two different phenotypes: small MCSP-positive and large MCSP-positive DCCs. While the small phenotype appears mostly in LNs with a low DCCD (DCC-density; number of DCCs per million mononuclear cells), the large phenotype could be found in LNs with a higher DCCD. Furthermore, we also observed LNs with both small and large DCCs, that had a medium DCCD.
Based on these findings we hypothesized that small MCSP-DCCs are precursors of large MCSP-DCCs and represent very early DCCs. In addition, we wanted to have a closer look at the two most common BRAF mutations in malignant melanoma and its association with the DCCD of the LNs. We hypothesized that acquisition of BRAF mutations marks the transition from pre-colonizing DCCs to colonizing DCCs and hence a significant progression step in systemic cancer development.
The hypothesis if small MCSP-positive DCCs are the precursors of large MCSP-positive DCCs should be investigated with the help of a cell lineage tree reconstruction based on short tandem repeats (STRs). To study the incidence of the BRAF mutations we established an allele-specific PCR with a blocking reagent (ASB-PCR) for DCCs.
The cell lineage tree reconstruction of patient MM15-127 resulted in three distinct clusters of DCCs. Two of the clusters were found in close proximity to the PT, while one DCC cluster was closer to the metastatic tumour cells than the PT. Both small and large MCSP-positive DCCs were found in the two clusters close to the PT. The cluster closer to the metastatic tumour cells only contained large MCSP-positive DCCs.
Retrospective testing of 80 DCCs with the established ASB-PCR resulted in the correct identification of wild type and mutant DCCs in 98% and 96% of the samples, respectively. From patient MM16-423, DCCs were isolated from the sentinel lymph node (SLN) and the non-SLNs and tested for BRAF mutations by the ASB-PCR. While the PT and the DCCs isolated from the SLN at primary diagnosis were wild type, the DCCs isolated from non-SLNs after LN relapse harboured a BRAF mutation. Testing a cohort of 150 malignant melanoma patients for BRAF mutations in DCCs, showed that 19.8% patients with a pathologically negative LN and 59.4% with a pathologically positive LN harboured a mutation. However, studying the incidence of the BRAF mutation depending on the DCCD, we found out that there is a large increase of the BRAF mutation from 14.9% in LNs with a DCCD>1≤10 to 62.5% in LNs with a DCCD>10≤30. Based on the result of the cell lineage tree reconstruction of patient MM15-127 our hypothesis that small MCSP-positive DCCs are the precursors of large MCSP-positive DCCs could neither be confirmed nor rejected. The resolution of the cell lineage tree is no yet good enough
8
to provide such accurate insights. However, three distinct clusters of DCCs were identified which could be an indication that DCCs disseminated at different time points. The ASB-PCR of DCCs from patient MM16-423 showed that BRAF mutations were acquired outside of the PT at a later time point of disease progression, when metastases were detected in the non-SLN. However, 62.5% of patients with a DCCD>10≤30 harboured a BRAF mutation, indicating that the BRAF mutation could be acquired early before colonisation of the DCCs.
Translation of the abstract (German)
Eine kürzlich durchgeführte Studie zur Metastasierung bei Melanomen zeigte, dass die lymphatische Dissemination sehr früh erfolgt. Disseminierte Krebszellen (DCCs) von Melanompatienten können den Primärtumor (PT) in einem genomisch unreifen Zustand verlassen, sich dann innerhalb der Lymphknoten (LNs) entwickeln und sich an die ektopische Umgebung anpassen, bis sie beginnen zu proliferieren und ...
Translation of the abstract (German)
Eine kürzlich durchgeführte Studie zur Metastasierung bei Melanomen zeigte, dass die lymphatische Dissemination sehr früh erfolgt. Disseminierte Krebszellen (DCCs) von Melanompatienten können den Primärtumor (PT) in einem genomisch unreifen Zustand verlassen, sich dann innerhalb der Lymphknoten (LNs) entwickeln und sich an die ektopische Umgebung anpassen, bis sie beginnen zu proliferieren und Metastasen bilden. Da die PT und die Metastase oft genetisch unterschiedlich sind, sollte der Fokus bei der Behandlung von Metastasen auf den DCCs liegen. Die molekulare Charakterisierung der DCCs, die den PT in einem frühen Stadium verlassen haben, könnte neue therapeutische Ziele gegen die Metastasierung aufzeigen. Nach routinemäßiger LN-Entfernung bei Melanom-Patienten wurden durch Färbung der LNs gegen den Tumormarker MCSP zwei unterschiedliche Phänotypen identifiziert: kleine MCSP-positive und große MCSP-positive DCCs. Während der kleine Phänotyp vor allem in LNs mit einer niedrigen DCCD (DCC-Dichte; Anzahl der DCCs pro Million mononukleärer Zellen) auftritt, konnte der große Phänotyp in LNs mit einer höheren DCCD gefunden werden. Darüber hinaus beobachteten wir auch LNs mit sowohl kleinen als auch großen DCCs, die einen mittleren DCCD aufwiesen.
Aufgrund dieser Befunde stellten wir die Hypothese auf, dass kleine MCSP-DCCs Vorläufer von großen MCSP-DCCs sind und sehr frühe DCCs darstellen. Darüber hinaus wollten wir die beiden häufigsten BRAF-Mutationen beim malignen Melanom und ihre Assoziation mit der DCCD der LNs näher betrachten. Wir stellten die Hypothese auf, dass der Erwerb von BRAF-Mutationen den Übergang von präkolonisierenden DCCs zu kolonisierenden DCCs und damit einen wichtigen Progressionsschritt in der systemischen Krebsentwicklung markiert.
Die Hypothese, ob kleine MCSP-positive DCCs die Vorläufer großer MCSP-positiver DCCs sind, sollte mit Hilfe einer Zellstammbaum-Rekonstruktion auf Basis von Short Tandem Repeats (STRs) untersucht werden. Zur Untersuchung der Inzidenz der BRAF-Mutationen etablierten wir eine allelspezifische PCR mit einem Blockierungsreagenz (ASB-PCR) für DCCs.
Die Rekonstruktion des Zellstammbaums des Patienten MM15-127 ergab drei unterschiedliche Cluster von DCCs. Zwei der Cluster befanden sich in unmittelbarer Nähe zum PT, während ein DCC-Cluster näher an den metastatischen Tumorzellen lag als am PT. Sowohl kleine als auch große MCSP-positive DCCs wurden in den beiden Clustern in der Nähe des PT gefunden. Der Cluster näher an den metastatischen Tumorzellen enthielt nur große MCSP-positive DCCs.
Die retrospektive Untersuchung von 80 DCCs mit der etablierten ASB-PCR ergab die korrekte Identifizierung von Wildtyp- und mutierten DCCs in 98% bzw. 96% der Proben. Vom Patienten MM16-423 wurden DCCs aus dem Sentinel-Lymphknoten (SLN) und den Nicht-SLNs isoliert und mit der ASB-PCR auf BRAF-Mutationen getestet. Während der PT und die DCCs, die bei der Primärdiagnose aus dem SLN isoliert wurden, Wildtyp waren, wiesen die DCCs, die nach dem LN-Rezidiv aus den Nicht-SLNs isoliert wurden, eine BRAF-Mutation auf. Die Untersuchung einer Kohorte von 150 malignen Melanompatienten auf BRAF-Mutationen in DCCs zeigte, dass 19,8% der Patienten mit einem pathologisch negativen LN und 59,4% mit einem pathologisch positiven LN eine Mutation aufwiesen. Bei der Untersuchung der Inzidenz der BRAF-Mutation in Abhängigkeit von der DCCD fanden wir jedoch heraus, dass es einen starken Anstieg der BRAF-Mutation von 14,9% in LNs mit einer DCCD>1≤10 auf 62,5% in LNs mit einer DCCD>10≤30 gibt. Basierend auf dem Ergebnis der Zellstammbaum-Rekonstruktion des Patienten MM15-127 konnte unsere Hypothese, dass kleine MCSP-positive DCCs die Vorläufer von großen MCSP-positiven DCCs sind, weder bestätigt noch verworfen werden. Die Auflösung des Zellstammbaums ist noch nicht gut genug
8
um solch genaue Erkenntnisse zu liefern. Es wurden jedoch drei unterschiedliche Cluster von DCCs identifiziert, was ein Hinweis darauf sein könnte, dass sich DCCs zu unterschiedlichen Zeitpunkten ausbreiteten. Die ASB-PCR von DCCs des Patienten MM16-423 zeigte, dass BRAF-Mutationen außerhalb des PT zu einem späteren Zeitpunkt der Krankheitsprogression erworben wurden, als Metastasen im Nicht-SLN nachgewiesen wurden. Allerdings trugen 62,5 % der Patienten mit einem DCCD>10≤30 eine BRAF-Mutation, was darauf hindeutet, dass die BRAF-Mutation früh vor der Kolonisation der DCCs erworben werden konnte.
Metadata last modified: 01 Mar 2022 07:16
Owner only: item control page
Download Statistics