Vergleichende in-vitro Untersuchung zur Aktivierung von Natürlichen Killerzellen aus der Leber und dem peripheren Blut im Kontext einer Hepatitis-C-Virusinfektion

URN zum Zitieren dieses Dokuments:: urn:nbn:de:bvb:355-epub-454691
DOI zum Zitieren dieses Dokuments:: 10.5283/epub.45469

Hess, Leonie

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Veröffentlichungsdatum dieses Volltextes: 07 Apr 2021 11:03

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Dokumentenart:	Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation)
Open Access Art:	Primärpublikation
Datum:	7 April 2021
Begutachter (Erstgutachter):	PD Dr. Jens M. Werner
Tag der Prüfung:	25 März 2021
Institutionen:	Medizin > Lehrstuhl für Chirurgie
Stichwörter / Keywords:	Hepatitis-C-Virus, Natürliche Killerzellen, unspezifische Immunantwort, Lymphozyten, Leber, Blut
Dewey-Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin
Status:	Veröffentlicht
Begutachtet:	Ja, diese Version wurde begutachtet
An der Universität Regensburg entstanden:	Ja
Dokumenten-ID:	45469

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Zusammenfassung (Deutsch)

Zusammenfassung (Deutsch)

Hintergrund
Die Arbeit sollte die angeborene Immunantwort auf das Hepatitis-C-Virus (HCV) untersuchen. Bei den meisten Publikationen zur Untersuchung der Reaktion des Immunsystems auf das HCV wurden ausschließlich aus humanem Blut isolierte Lymphozyten (PBL) analysiert. Das Ziel dieser Arbeit war es die Immunantwort auf das HCV durch intrahepatische Lymphozyten (IHL) zu untersuchen. Dies ist insofern relevant, als dass das HCV nur in Hepatozyten repliziert und daher primär mit den lokalen IHL in Kontakt tritt. Außerdem unterscheiden sich IHL von PBL in ihrer Zusammensetzung.

Methoden
In unseren Untersuchungen wurden PBL sowie IHL eines Patienten mit Huh7-Zellen, welche mit einem HCV-Replikon transfiziert, sowie mit Huh7-Zellen ohne einem solchen Replikon als Negativkontrolle in Ko-Kultur gegeben. Die verbleibende HCV-RNA Replikation der Replikon-Zellen nach der Ko-Kultur wurde anschließend mittels einer Luciferase-Messung bestimmt. Die PBL und IHL wurden hingegen mittels Durchflusszytometrie, bzw. FACS- Sorting (Flourenscence Activated Cell Sorting) untersucht. Dabei wurde die Ausschüttung der Zytokine TNF-α und INF-γ sowie der Marker für Zytotoxizität TRAIL und CD107a durch Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) analysiert. Zuletzt wurde im Überstand der Ko-Kulturen die Quantität des Enzyms Lactat-Dehydrogenase (LDH) mittels LDH-Assay als weiterer Marker für Zytotoxizität bestimmt.

Ergebnisse
In der Arbeit konnte gezeigt werden, dass die virale Aktivität von Replikon-Zellen nach Ko-Kultur mit IHL signifikant vermindert war. IHL hatten somit einen stärkeren antivirale Effekt auf das HCV als PBL. Nach der Entfernung von CD56+ NK-Zellen sowie CD14+ mononukleäre Zellen aus PBL und IHL konnte ein signifikanter Anstieg der viralen Aktivität der Replikon-Zellen im Vergleich zu dem Gesamtpopulationen gemessen werden. Es konnte somit gezeigt werden, dass sowohl in PBL als in IHL CD56+ NK-Zellen als auch CD14+ Zellen Einfluss auf die antivirale Aktivität gegen das HCV hatten. Der Unterschied in der antiviralen Aktivität zwischen IHL und PBL lässt sich am ehesten durch eine stärkere Aktivierung von intrahepatischen NK-Zellen im Vergleich zu peripheren NK-Zellen erklären. NK-Zellen in IHL nach Kontakt mit HCV produzierten in unseren Untersuchungen signifikant mehr TNF-α als nach Kontakt mit Lunet-Zellen ohne Replikon. Dies ließ sich für NK- Zellen in PBL nicht nachweisen. Des Weiteren konnte bei NK-Zellen in PBL, jedoch nicht in IHL, eine Abhängigkeit der Produktion von TNF-α durch CD14+ Zellen nachgewiesen werden. Außerdem zeigte sich eine Abhängigkeit der Expression des Zytotoxizitäts-Markers TRAIL von CD14+ Zellen in IHL. Ein relevanter Unterschied in der Expression dieses Markers nach Kontakt mit dem HCV-Replikon im Vergleich zur Ko-Kultur mit Lunet-Zellen ohne Replikon konnte weder für PBL noch für IHL festgestellt werden.

Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)

Background
This work aimed to investigate the innate immune response to the hepatitis C virus (HCV). Most publications investigating the immune system response to HCV have analyzed only lymphocytes isolated from human blood (PBL). The aim of this work was to study the immune response to HCV by intrahepatic lymphocytes (IHL). This is of relevance because HCV replicates only in hepatocytes and therefore primarily contacts local IHL. In addition, IHL differ from PBL in their composition.

Methods
In our studies, PBL as well as IHL from a patient with Huh7 cells transfected with an HCV replicon and Huh7 cells without such a replicon were given as negative controls in co-culture. The remaining HCV RNA replication of the replicon cells after co-culture was subsequently determined by luciferase measurement. In contrast, PBL and IHL were examined by flow cytometry, and FACS- sorting (Flourenscence Activated Cell Sorting), respectively. The release of the cytokines TNF-α and INF-γ as well as the markers for cytotoxicity TRAIL and CD107a by natural killer cells (NK cells) was analyzed. Last, the quantity of the enzyme lactate dehydrogenase (LDH) was determined in the supernatant of the co-cultures by LDH assay as another marker for cytotoxicity.

Results
This work demonstrated that the viral activity of replicon cells was significantly decreased after co-culture with IHL. IHL thus had a stronger antiviral effect on HCV than PBL. After removal of CD56+ NK cells as well as CD14+ mononuclear cells from PBL and IHL, a significant increase in viral activity of replicon cells was measured compared with the total population. Thus, it could be shown that in both PBL and IHL CD56+ NK cells as well as CD14+ cells had influence on the antiviral activity against HCV. The difference in antiviral activity between IHL and PBL is most likely explained by greater activation of intrahepatic NK cells compared with peripheral NK cells. NK cells in IHL after contact with HCV produced significantly more TNF-α than after contact with Lunet cells without replicon in our studies. This could not be demonstrated for NK- cells in PBL. Furthermore, a dependence of TNF-α production by CD14+ cells was demonstrated for NK cells in PBL but not in IHL. In addition, the expression of the cytotoxicity marker TRAIL was shown to be dependent on CD14+ cells in IHL. A relevant difference in the expression of this marker after contact with the HCV replicon compared with the co-culture with Lunet cells without replicon could not be detected for either PBL or IHL.

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