With the continuous emergence of resistant bacterial strains, the urgent need for novel antibiotics is unquestionable. Lantibiotics are a group of ribosomally produced and posttranslationally modified peptides, which display antibiotic activity. The lantibiotic nisin, a 34 amino acid peptide, shows antibiotic activity mainly against gram-positive bacteria. By introducing non-canonical amino acids ...
Zusammenfassung (Englisch)
With the continuous emergence of resistant bacterial strains, the urgent need for novel antibiotics is unquestionable. Lantibiotics are a group of ribosomally produced and posttranslationally modified peptides, which display antibiotic activity. The lantibiotic nisin, a 34 amino acid peptide, shows antibiotic activity mainly against gram-positive bacteria. By introducing non-canonical amino acids (ncAA) to nisin, chemical properties can be altered, potentially facilitating therapeutic usage or increasing its antibiotic range.
The aim of this work was the identification of suitable positions of nisin for incorporation of the non-canonical amino acid Boc-Lysin (Boc-K) using amber suppression in E. coli and quantification of the suppression efficiency.
First, vector constructs containing nisin, fused in-frame with the reporter protein GPF, as well as the assay set up were optimized. Expression of nisin variants was quantified using a fluorescence assay. A screening of all variants indicated high GFP expression levels compared to wild-type nisin constructs. The maximum was measured for position 13 (175 %) and 16 (189 %), depending on the suppressor pair used. However, quality control experiments revealed high fluorescence intensity levels even when the ncAA was not present in the media. Further analysis of the expressed proteins showed that the methionines within nisin allowed internal translation starts after interruption of translation due to the amber stop codon. For this reason, only results from the rear part of nisin, with amber suppression taking place after the last internal methionine were analyzed for the initial objective. These results from stop codon suppression from amino acid position 21 of nisin and further towards the C-terminus showed satisfactory suppression efficiencies compared to nisin wild-type expression, ranging from 15 % to 68 %. Two amino acid positions in nisin were particularly promising regarding protein yields, namely position 21 (66 %) and 31 (68 %), depending on the suppressor pair used.
In summary, this work showed that incorporation of non-canonical amino acids in nisin using amber suppression is feasible and provides satisfactory suppression efficiencies. However, internal translation starts impeded analysis of positions 1 to 20. For avoiding the latter, further work, e.g. substitution of the methionines within nisin with other amino acids is necessary.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Mit kontinuierlicher Zunahme resistenter Bakterienstämme ist die dringende Notwendigkeit neuer Antibiotika unstrittig. Lantibiotika sind eine Gruppe ribosomal produzierter und posttranslational modifizierter Peptide mit antibiotischer Wirkung. Das Lantibiotikum Nisin, ein Peptid aus 34 Aminosäuren, ist überwiegend gegen grampositive Bakterien antibiotisch wirksam. Durch den Einbau ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Mit kontinuierlicher Zunahme resistenter Bakterienstämme ist die dringende Notwendigkeit neuer Antibiotika unstrittig. Lantibiotika sind eine Gruppe ribosomal produzierter und posttranslational modifizierter Peptide mit antibiotischer Wirkung. Das Lantibiotikum Nisin, ein Peptid aus 34 Aminosäuren, ist überwiegend gegen grampositive Bakterien antibiotisch wirksam. Durch den Einbau nicht-kanonischer Aminosäuren (ncAA) in Nisin können chemische Eigenschaften verändert werden, welche potentiell die therapeutische Anwendung erleichtern oder das antibiotische Wirkspektrum erweitern können.
Das Ziel dieser Arbeit war die Identifikation passender Positionen in Nisin für den Einbau der nicht-kanonischen Aminosäure Boc-Lysin (Boc-K) mittels Amber Suppression in E. coli und Quantifizierung der Suppressionseffizienz.
Hierfür wurden zunächst die Vektorkonstrukte, die Nisin und das daran in-frame gekoppelte Reporter Protein GFP enthalten, sowie der Versuchsaufbau optimiert. Die Expression der Nisin Varianten wurde durch eine Fluoreszenzmessung quantifiziert. Ein Screening aller Varianten zeigte hohe GFP Expressionslevel im Vergleich zu Nisin Wildtyp Konstrukten. Maximalwerte wurden für die Positionen 13 (175 %) und 16 (189 %), abhängig vom verwendeten Suppressorpaar, gemessen. Experimente zur Qualitätskontrolle zeigten jedoch, dass hohe Fluoreszenz-intensitäts-Level gemessen wurden, auch wenn die ncAA nicht im Medium vorhanden war. Weiterführende Analysen der exprimierten Proteine zeigten, dass Methionine in Nisin interne Translationsstarts ermöglichten, nachdem die Translation durch das Amber Stopp Codon abgebrochen war. Aus diesem Grund konnten nur Ergebnisse aus dem hinteren Anteil von Nisin für die ursprüngliche Fragestellung verwertet werden, da die Amber Suppression hier nach dem letzten internen Methionin stattfand. Die Ergebnisse der Stopp Codon Suppression ab Nisin-Position 21 zeigten zufriedenstellende Suppressionseffizienzwerte zwischen 15% und 68% im Vergleich zur Nisin Wildtyp Expression. Zwei Aminosäurepositionen von Nisin zeigten besonders vielversprechende Proteinerträge: Position 21 (66 %) und 31 (68 %), abhängig vom verwendeten Suppressorpaar.
Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass der Einbau von ncAA in Nisin mittels Amber Suppression funktioniert und zufriedenstellende Suppressionseffizienz-werte erzielt wurden. Interne Translationsstarts verhinderten jedoch die Analyse der Positionen 1 bis 20. Um dieses Problem zu umgehen sind weitere Arbeiten nötig, beispiels-weise um die Methionine innerhalb von Nisin durch andere Aminosäuren zu ersetzen.
Downloadstatistik