Circular RNAs (circRNAs) are covalently closed, single-stranded endogenous RNAs lacking 5′ end caps and 3′ poly(A) tails. Although the low abundance, these molecules show cell type-, tissue- or developmental stage-specific expression. For decades, circRNAs were considered as byproducts of aberrant splicing. Recent findings unrevealed their cellular functions such as microRNA (miRNAs) or RNA ...
Abstract (English)
Circular RNAs (circRNAs) are covalently closed, single-stranded endogenous RNAs lacking 5′ end caps and 3′ poly(A) tails. Although the low abundance, these molecules show cell type-, tissue- or developmental stage-specific expression. For decades, circRNAs were considered as byproducts of aberrant splicing. Recent findings unrevealed their cellular functions such as microRNA (miRNAs) or RNA binding proteins (RBPs) sponges, scaffolds and decoys. Although circRNA biogenesis is considerably well understood, it remains intriguing how circRNAs are ultimately degraded, as they are stable and resistant to RNA exonucleolytic decay. Using a biochemical approach, we aim to identify the cellular degradation pathways of circRNAs and the endonucleases involved. To achieve this purpose, using an enzymatic ligation method, we performed in vitro synthesis of selected circRNAs and confirmed their circularity. Then, we measured the stability of the synthetic circRNAs and their linear counterpart in cell lysates of different purification approaches. Our data confirmed the high stability of circRNAs compared to the linear counterparts and showed high sensitivity of degradation for circular RNAs in cytoplasmic extracts suggesting cytoplasmic decay pathways. Next, we used mass spectrometry analysis to identify the endonucleases involved in circRNAs degradation and validated them with in vitro degradation assays. Furthermore, we characterized the function of DIS3 and its PIN domain using in vitro and in vivo experiments. In vitro experiments show that DIS3 can degrade synthetic circRNAs alone or associated with the exosome and that the PIN domain is responsible for its endoribonuclease activity. RNA-seq analysis from CRISPR/Cas9-mediated DIS3 knockout cells confirmed the potential role of DIS3 in degrading a subset of circRNAs. Among them, three candidates such as circOXCT1, circRERE and circFAM208, show upregulation in DIS3 knockout while their linear RNA counterparts do not change. Finally, proteomic studies of DIS3 function in the nucleus and cytoplasm elucidate the molecular mechanisms behind the regulation of DIS3, which might affect circRNA metabolism. Altogether our study adds a new aspect to the function of DIS3 in regulating circRNA degradation pathway.
Translation of the abstract (German)
Zirkuläre RNAs (circRNAs) sind kovalent geschlossene, einzelsträngige, endogene RNAs, die weder im Besitz einer 5′-Endkappe oder eines 3′-Poly(A)-Schwanzes sind. Trotz ihrer geringen Abundanz zeigen diese Moleküle eine hohe Spezifität bezüglich ihrer Expression, die vom Zelltyp, dem Gewebe oder dem Entwicklungsstadium beeinflusst wird. Jahrzehntelang galten circRNAs als Nebenprodukte des ...
Translation of the abstract (German)
Zirkuläre RNAs (circRNAs) sind kovalent geschlossene, einzelsträngige, endogene RNAs, die weder im Besitz einer 5′-Endkappe oder eines 3′-Poly(A)-Schwanzes sind. Trotz ihrer geringen Abundanz zeigen diese Moleküle eine hohe Spezifität bezüglich ihrer Expression, die vom Zelltyp, dem Gewebe oder dem Entwicklungsstadium beeinflusst wird. Jahrzehntelang galten circRNAs als Nebenprodukte des aberranten Spleißens. Jüngste Ergebnisse haben jedoch ihre zellulären Funktionen als Schwämme für microRNAs (miRNAs) oder RNA-bindende Proteine (RBPs) sowie ihre Gerüst- und Köderfunktion offenbart. Obwohl die Biogenese von circRNAs inzwischen sehr gut verstanden ist, bleibt es eine faszinierende und noch unergründete Frage, wie circRNAs letztendlich abgebaut werden, da sie stabil und resistent gegenüber exonukleolytischen Verdauprozessen sind. Unser Ziel war es, mittels eines biochemischen Ansatzes die zellulären Abbauwege von circRNAs und die dabei beteiligten Endonukleasen zu identifizieren.
Um dies zu erreichen, haben wir über eine enzymatische Ligation eine in vitro Synthese ausgewählter circRNAs durchgeführt und deren Zirkularität bestätigt. Anschließend haben wir die Stabilität der synthetischen circRNAs und die ihrer linearen Gegenstücke in unterschiedlich aufgereinigten Zelllysaten untersucht. Unsere Daten bestätigten die hohe Stabilität von circRNAs im Vergleich zu ihren linearen Gegenstücken und zeigten eine hohe Empfindlichkeit dieser Stabilität in zytoplasmatischen Extrakten, was auf zytoplasmatische Abbauwege hindeutete. Als nächstes verwendeten wir massenspektrometrische Analysen, um die am Abbau circulärer RNAs beteiligten Endonukleasen zu identifizieren und validierten diese über in vitro Abbau Experimente. Darüber hinaus haben wir die Funktion von DIS3 und die seiner PIN-Domäne mit in vitro und in vivo Experimenten charakterisiert. In vitro Experimente zeigten, dass DIS3 synthetische circRNAs sowohl allein als auch in Verbindung mit dem Exosom abbauen kann und dass die PIN-Domäne für dessen Endoribonuklease Aktivität verantwortlich ist. RNA-seq Analysen aus mittels CRISPR/Cas9 generierten DIS3 Knockout-Zelllinien bestätigten die potenzielle Beteiligung von DIS3 beim Abbau von zumindest einer Untergruppe circulärer RNAs. Darunter zeigten Kandidaten wie die drei RNAs circOXCT1, circRERE und circFAM208 eine Hochregulation im DIS3-Knockout, während sich die Level ihrer linearen RNA-Gegenstücke nicht änderten. Zuletzt klärten wir mittels proteomischen Studien zur Funktion von DIS3, entweder im Zellkern oder im Zytoplasma, die molekularen Mechanismen hinter der Regulation von DIS3 auf, die den circRNA-Stoffwechsel beeinflussen könnten. Alles in allem trägt unsere Studie einen neuen Aspekt zur Funktion von DIS3 bei, welche die Regulierung von circRNA Abbauwegen beschreibt.
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