| License: Publishing license for publications excluding print on demand (7MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-514722
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.51472
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 21 January 2022 |
| Referee: | Prof.Dr. Denitsa Docheva and Prof.Dr. Wolfgang Bäumler and Prof.Dr. Hauke Clausen-Schaumann |
| Date of exam: | 21 December 2021 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Unfallchirurgie |
| Keywords: | laser-induced forward transfer (LIFT); film-free LIFT; single-cell bioprinting; tissue engineering; femtosecond laser-based bioprinting |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 51472 |
Abstract (German)
Tissue Engineering basiert auf der Erzeugung künstlicher Gewebe durch eine Kombination von Zellen und geeigneten, biokompatiblen Materialien, zur Reparatur, zum Ersatz oder zur Regeneration von erkranktem oder beschädigt Gewebe. Die größte Herausforderung bei der Herstellung von funktionellem Gewebeersatz ex vivo liegt in der Replikation und Nachahmung der komplexen und einzigartig ...
Abstract (German)
Tissue Engineering basiert auf der Erzeugung künstlicher Gewebe durch eine Kombination von Zellen und geeigneten, biokompatiblen Materialien, zur Reparatur, zum Ersatz oder zur Regeneration von erkranktem oder beschädigt Gewebe. Die größte Herausforderung bei der Herstellung von funktionellem Gewebeersatz ex vivo liegt in der Replikation und Nachahmung der komplexen und einzigartig Gewebemikroarchitektur aus verschiedenen Zelltypen und der extrazellulären Matrix. Die Zellnische im Sehnengewebe beispielsweise ist durch eine strikte hierarchische Organisation von Kollagen-1-Fasern und eingebetteten Sehnenzellen in hochparallelen Reihen gekennzeichnet, die die Basis für die einzigartige und anisotrope Gewebemorphologie der Sehne bilden.
Der Laser-induzierter Zelltransfer ist ein vielversprechender Ansatz für das schnelle Drucken von Biomolekülen und Säugetierzellen mit hoher räumlicher Genauigkeit. Die übertragenen Zellen haben eine hohe Überlebensrate und behalten ihre Fähigkeit zur Proliferation und Differenzierung. Die meisten bisherigen Verfahren benutzen allerdings auf dünne anorganische Opferschichten für die Lichtabsorption, was dazu führt, dass beim Zelltransfer auch Materialspuren dieser Opferschicht mitübertragen werden und das Produkt kontaminieren. In den anderen Fällen werden proteinbasierte Hydrogele wie Gelatine, Matrigel oder Kollagen für die Energieabsorption verwendet. Diese proteinbasierten Absorptionsschichten erfordern jedoch UV-Laserquellen mit Wellenlängen unter 200 nm für eine effektive Energieabsorption, was die Gefahr von DNA-Schäden und Karzinogenese mit sich bringt.
In dieser Arbeit wird ein neuartiges laserinduziertes Bioprinting-Verfahren für den Transfer von Hydrogelen und lebenden Säugetierzellen vorgestellt, z. B. menschliche mesenchymale Zellen, der erstmals sowohl den Einsatz von nicht-biologischen, anorganischen Absorptionsschichten als auch von UV-Laserquellen vermeidet. Um den Transferprozess zu analysieren und die Transferparameter weiter zu optimieren, wurde ein Setup implementiert, das zeitaufgelöste mikroskopische Aufnahmen des Transferprozesses in Seitenansicht ermöglicht. Die Auswirkungen der experimentellen Parameter wie Laserpulsenergie, Fokustiefe, Hydrogel-Viskosität, Laserpulsdauer und sphärische Aberration des Objektivs auf die Kinetik der induzierten Kavitationsblase und des daraus entstehenden Hydrogel-Jets sowie die entsprechende Hydrodynamik wurden systematisch untersucht. Mit zunehmender Jetgeschwindigkeit ändert sich das Jetverhalten: Ist der Jet zu langsam, verbleibt das Hydrogel im Reservoir und es erfolgt kein Transfer. Bei höheren Geschwindigkeiten wird ein laminarer Jet erzeugt, der sich gradlinig zum Akzeptor-Substrat bewegt. Wird Geschwindigkeit weiter erhöht, kommt es zu einem leicht gekrümmten Jet, was die genaue Positionierung beeinträchtigt und schließlich zu einem unkontrollierten Verspritzen des Hydrogels. Um maximale laterale Auflösung auf dem Akzeptor, die dem minimalen Durchmesser des Hydrogelspots entspricht) und damit die beste Positionierungsgenauigkeit (die mittlere quadratische Abweichung der Zellpositionen von einer willkürlich gewählten Zielposition) zu erhalten, sollte möglichst die Schwellenenergie für den Transfer von Hydrogel und Zellen gewählt werden. In diesem Fall ist die kinetische Energie für die Jetausbreitung gerade hoch genug, um die Oberflächenenergie des Hydrogels und die Gravitation zu überwinden, was zu einem Ablösen des primären Tropfens, der die ausgewählten Zellen enthält, vom Hydrogeljet führt und es dem Tropfen anschließend ermöglicht, gegen die Schwerkraft auf den Akzeptor zu gelangen. Zellschädigungen in diesem Prozess, werden möglicherweise durch die sich rasch ausdehnende Kavitationsblase, die Scherkräfte, denen die Zelle bei der Bewegung durch das Hydrogel ausgesetzt ist, und die Kräfte, die durch den Aufprall auf dem Akzeptor entstehen, verursacht. Wir konnten jedoch zeigen, dass solche Zellschädigungen durch die Verwendung des Schwellenwerts deutlich reduziert und minimiert werden können. Zellen, die unter diesen Bedingungen übertragen werden, zeigen Zellüberlebensraten auf dem Zielsubstrat von 93-99%. Sie behalten ihre Fähigkeit zu migrieren und zu proliferieren und zeigen normales, zelltypspezifisches Verhalten nach dem Transfer. Es konnten keine DNA-Doppelstrangbrüche nachgewiesen werden. Für die Selektion und anschließende Sortierung einzelner Zellen aus heterogenen Zellpopulationen anhand von Zellmorphologie (z. B. Zellform oder -größe) fluoreszierender Marker wurde in das bestehende Transfer-Setup ein inverses Lichtmikroskop integriert. Mit diesem Aufbau konnte eine Positioniergenauigkeit von nahezu 10 µm auf dem Zielsubstrat realisiert werden. Darüber hinaus haben erste Experimente gezeigt, dass mit diesem Aufbau das Verdrucken von Hydrogelen in 3D möglich ist. So konnten wir erfolgreich einen laserbasierten Ansatz zum Aufbau der für die Sehnennische charakteristischen Zellreihenstruktur demonstrieren.
Die Integration eines inversen Lichtmikroskops ermöglicht in Zukunft den Einsatz einer automatisierten Bildanalyse und einer Zellerkennungssoftware, was eine Voraussetzung für einen vollautomatischen Prozess ist. Durch die Verwendung eines Multiplexing-Ansatzes mit schnellen Laserscannern sollen so wesentlich schnellere Zellübertragungsraten erreicht werden, als das derzeit möglich ist. Der in dieser Arbeit vorgestellte Ansatz ermöglicht somit in Zukunft die präzise, schnelle und zellschonende Herstellung von Präzisionsnichoide, 3D-Organoide Zellchips, Organs-on-Chips und letztlich von funktionellem Gewebeersatz.
Translation of the abstract (English)
Tissue Engineering is based on the generation of artificial tissues through a combination of cells and suitable, biocompatible materials to repair, replace or regenerate diseased or injured tissue. However, the major challenge in producing functional tissue substitutes ex vivo lies in the replication of the complex and unique tissue microarchitecture of native tissue, consisting of different cell ...
Translation of the abstract (English)
Tissue Engineering is based on the generation of artificial tissues through a combination of cells and suitable, biocompatible materials to repair, replace or regenerate diseased or injured tissue. However, the major challenge in producing functional tissue substitutes ex vivo lies in the replication of the complex and unique tissue microarchitecture of native tissue, consisting of different cell types and ECM. The cell niche in tendon tissue, for example, is characterized by a strictly hierarchical organization of collagen-1 fibers and embedded tendon cells in highly parallel rows that form the basis for the unique and anisotropic tissue morphology of the tendon.
Laser-induced cell transfer presents a promising approach for the fast printing of biomolecules and mammalian cells with high spatial accuracy. The transferred cells have a high survival rate and maintain their ability to proliferate and differentiate. Nevertheless, for the absorption of the laser energy, most previous setups relied on inorganic light absorbing sacrificial thin films, and inorganic material was transferred to the printed product along with the cells and contaminates the product. In some cases, protein-based hydrogels, such as gelatin, Matrigel or collagen have been used for energy absorption. However, these protein-based absorbing layers require UV laser sources with wavelengths below 200 nm for effective energy absorption, which brings along the risk of DNA damage and carcinogenesis.
In this thesis, a novel film-free laser-induced bioprinting approach for the transfer of living mammalian cell e.g. human mesenchymal cells is presented, which for the first time avoid both, the use of non-biological, inorganic absorption layers and of UV laser sources. To analyze the transfer process and further optimize the transfer parameters, a laterally time-resolved microscopic setup was implemented to observe the transfer process. The effects of the experimental parameters such as laser pulse energy, focus depth, hydrogel viscosity, laser pulse duration and spherical aberration of the microscope objectives on the cavitation bubble formation and jet kinetics and the corresponding hydrodynamics have been systematically investigated. As the jet velocity increases, the jet behavior changes: if the jet is too slow, the hydrogel remains in the reservoir and no transfer occurs. At higher speeds, a laminar jet is generated which moves in a straight line to the acceptor substrate. As the velocity increases further, a slightly curved jet occurs, which affects accurate positioning and eventually leads to uncontrolled splashing of the hydrogel. To obtain the maximum lateral resolution (hydrogel spot diameter) and best positioning accuracy (the root mean square deviation of the cell positions from an arbitrary chosen target position), the threshold energy for hydrogel and cell transfer should be selected. In this case, the kinetic energy for the jet propagation is just high enough to overcome the hydrogel surface energy and gravity, resulting in a breakup of the primary droplet containing the selected cells and subsequently allowing the droplet to reach the acceptor. The mechanical stress from the expanding cavitation bubble, shear forces, as cells are moving through the hydrogel, and forces caused by the impact of landing on the acceptor are believed to be the key source of cell damage. However, we could show that cell damage could be significantly reduced and minimized by using the threshold transfer conditions. Under threshold conditions, the transferred cells have 93–99% survival rates on a target substrate. They maintain their ability to migrate and proliferate, and show normal, cell type specific behavior after transfer. No DNA double strand breaks could be detected. In addition, the transfer setup was integrated into an inverted optical microscope, which allowed to select and sort individual cells from heterogeneous cell populations, based on cell morphology (e.g. cell shape or size) or fluorescence markers and to position them on the target substrate with a positioning accuracy close to 10 µm. Thus, we could successfully demonstrate a laser-based approach to build the cell row structure that is characteristic of the tendon niche.
After all, our hydrogel bioprinting approach can readily be extended from 2D into 3D. The integration into an inverted optical microscope setup, will allow for the use of automated image analysis and a cell recognition software in the future, which is a prerequisite for a fully automated process. By using a multiplexing approach with fast laser scanners, one can envision much faster cell-transfer rates in the future than currently possible. The approach presented in this thesis will thus enable the precise, fast, and cell-friendly fabrication of precision nichoids, 3D organoids, cell-chips, organs-on-chips, , and ultimately of functional tissue substitutes in the future.
Metadata last modified: 21 Jan 2022 07:26
Owner only: item control page
Download Statistics