Identifizierung und Charakterisierung von disseminierten Tumorzellen bei Nicht-Kleinzelligem Lungenkrebs

URN to cite this document:: urn:nbn:de:bvb:355-epub-519557
DOI to cite this document:: 10.5283/epub.51955

Mederer, Tobias

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License: Creative Commons Attribution 4.0
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Date of publication of this fulltext: 15 Mar 2023 05:45

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Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Open Access Type:	Primary Publication
Date:	15 March 2023
Referee:	Prof. Dr. Christoph A. Klein
Date of exam:	17 March 2022
Institutions:	Medicine > Lehrstuhl für experimentelle Medizin und Therapieverfahren
Keywords:	disseminated tumor cell; metastasis; early dissemination; bone marrow; lymph node; lung cancer; biomarker
Dewey Decimal Classification:	500 Science > 570 Life sciences 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	51955

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Abstract (German)

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Trotz bestmöglicher Therapie von NSCLC in frühen Stadien versterben viele der Patienten an der metastatischen Aussaat - auch nach kurativer Resektion des Tumors und adjuvanter Therapie. Das Modell der parallelen Progression und der frühen Tumorzell-Disseminierung bietet eine mögliche Erklärung für dieses Phänomen, wobei bereits sehr früh Tumorzellen in distante Organe streuen (DTCs) und dort in einer schlafenden Phase (und somit resistent gegenüber einer Chemotherapie, die meist in die Zellteilung eingreift) überleben. Diese Zellen stellen somit ein Reservoir an möglichen Metastasen-initiierenden Zellen dar.
Das Ziel dieser Studie war die Untersuchung der minimalen Resterkrankung (MRD) in Lymphknoten und Knochenmark von NSCLC Patienten mittels epithelialer Immunfärbung (Epithelial Cell Adhesion Molecule / EpCAM und Zytokeratinen / CK) in mesenchymalen Organen. Da der Nachweis dieser Zellen in NSCLC zu widersprüchlichen Ergebnissen in Bezug auf die klinische Relevanz / das Überleben der Patienten zeigte, sollte anhand eines mehrjährigen Follow-Up dieser Patienten die Assoziation zu klinischen Merkmalen untersucht werden. Des Weiteren sollten, da auch bei gesunden Patienten EpCAM-positive Zellen detektiert werden können, durch weitergehende genetische Analyse echte disseminierte Tumorzellen identifiziert und charakterisiert werden.
In dieser Arbeit wurden EpCAM und CK-positive Zellen - als putative DTCs - aus dem Knochenmark und lokoregionären Lymphknoten in NSCLC Patienten untersucht. Bereits der Nachweis mindestens einer EpCAM-positiven Zelle im Lymphknoten oder dem Knochenmark zeigte ein signifikant reduziertes Überleben. Dieser Effekt konnte mit einer genspezifischen EpCAM-PCR zum Nachweis des Transkriptes noch verbessert werden, wobei hier selbst in Patienten ohne Lymphknotenmetastasen (pN0) ein prognostischer Nutzen sichtbar war.
Die gezielte Analyse weiterer ausgewählter Gene erlaubte jedoch keine eindeutige Trennung von EpCAM-positiven Zellen aus NSCLC oder gesunden Kontrollpatienten. Auch die Sequenzierung des am häufigsten mutierten Gen in NSCLC Tumoren - TP53 - war aufgrund der niedrigen Detektionsraten nicht zur routine-mäßigen Identifizierung von echten DTCs geeignet und zeigte weiterhin, dass die Disseminierung dieser Zellen vermutlich zu sehr frühen Stadien der Tumorentwicklung erfolgt.
Letztlich wurden die Genome der DTCs sequenziert und der maligne Ursprung durch ein aberrantes Genomprofil klassifiziert. Die Daten deuten darauf hin, dass es unterschiedliche Subpopulationen von DTCs gibt, die womöglich verschiedene Stadien der genetischen Reifung von DTCs darstellen. So könnte die aktive Transkription von EpCAM ein Aktivierungsmarker für DTCs in genetisch reifen bzw. reiferen Stadien darstellen, da diese Zellen häufiger Aberrationen aufweisen und mit einem signifikant schlechteren Überleben korrelieren.
Die Analyse der Genexpression dieser Zellen mittels RNA-Seq erlaubte die Einteilung in fünf distinkte Gruppen. Hier konnte ein durchaus hohes Ausmaß an Plastizität der Genexpression beobachtet werden, da vier der fünf Gruppen einen hämatopoietischen Phänotyp aufweisen. In allen Gruppen, die aberrante Zellen beinhalten (4/5) konnte zudem ein Effekt auf das Überleben der Patienten beobachtet werden.
Die Ergebnisse dieser Arbeit liefern erste Einblicke in die Genetik der frühen Disseminierung bei NSCLC Patienten, wobei einige essentielle Fragen wie zum Beispiel die Identität v.a. der Knochenmark-Kontrollzellen weiterhin offenbleiben. Eine weitergehende Analyse dieser Zellen eröffnet möglicherweise neue Behandlungsstrategien und könnte wertvolle Informationen zu der Metastasierung von NSCLC Tumoren liefern.

Translation of the abstract (English)

Even after putatively curative therapy with surgery and adjuvant therapy in early-stage NSCLC, metastasis is a predominant cause of death in these patients. The model of parallel progression and early tumor cell dissemination provides a possible explanation for this phenomenon. Early seeding of tumor cells results in disseminated tumor cells that might survive for years in a dormant phase, providing a reservoir of potentially metastasis-initiating cells.
The goal of this study was to analyze the minimal residual disease in lymph node and bone marrow of NSCLC patients by single-cell EpCAM and cytokeratin staining. Since those cells can also be detected in healthy controls, genetic analyses were performed to identify true disseminated tumor cells and genetically characterize them.
Even the detection of one single EpCAM-positive cells in lymph node or bone marrow correlated with significantly reduced survival. This effect was even more pronounced when analyzing EpCAM transcript detection by PCR. Using this, a prognostic value could be seen even for pN0 patients.
Analysis of specific transcripts was not able to differentiate putative DTCs in NSCLC patients from healthy controls. TP53 mutation analysis by Sanger sequencing was not feasible due to low detection rates.
Finally, true DTCs were classified by an aberrant genome. Our data suggests that different subpopulations of DTCs exist, possibly representing different stages of (genetic) maturation. Active transcription of EpCAM might be used as an activation marker for DTCs, since they more frequently present with genomic aberrations and correlate with decreased survival.
Gene expression analysis by RNA-Seq resulted in 5 distinct clusters. A high phenotypic plasticity could be observed, as four of the five subgroups displayed immunologic/hematopoietic phenotypes. Still, most groups (4/5) contained EpCAM-positive cells with genomic aberrations.
This study provide first insights into the genetics of early dissemination in NSCLC. Some questions, e.g. the origin/identity of EpCAM-positive cells in healthy controls remain unanswered. Further genetic analysis might provide valuable information on the metastatic cascade in NSCLC tumors.

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