Das Amnionepithel: Eine mögliche Stammzellquelle für die regenerative Endodontie?

URN to cite this document:: urn:nbn:de:bvb:355-epub-540135
DOI to cite this document:: 10.5283/epub.54013

Ohlsson, Ella

License: Creative Commons Attribution 4.0
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Date of publication of this fulltext: 31 Mar 2023 08:02

Details

Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Date:	31 March 2023
Referee:	PD Dr. Matthias Widbiller
Date of exam:	30 March 2023
Institutions:	Medicine > Lehrstuhl für Zahnerhaltung und Parodontologie
Keywords:	Dental Pulp Stem Cells, Human Amniotic Epithelial Stem Cells, Pulp Regeneration, Dentine Matrix Proteins, Pulparegeneration
Dewey Decimal Classification:	600 Technology > 610 Medical sciences Medicine
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	54013

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Abstract (German)

Abstract (German)

Zielsetzungen: Das Ziel der regenerativen Endodontie ist es, geschädigtes Pulpagewebe zu ersetzen und seine biologische Funktion wiederherzustellen.
Im Rahmen des endodontischen Tissue Engineerings kann die Transplantation multipotenter dentaler Pulpastammzellen (DPSC) die Bildung von pulpaähnlichem Gewebe bewirken, ihre Verfügbarkeit ist jedoch begrenzt. Daher soll die Verwendung von pluripotenten humanen Amnionepithelzellen (HAEC), die in großer Zahl aus der Plazenta gewonnen werden können, als alternative Stammzellquelle untersucht werden.

Material und Methoden: HAEC wurden aus Plazenten durch Trypsinierung der Amnionmembran isoliert und per Durchflusszytometrie charakterisiert (CD44/CD49f/CD105/CD326), während DPSC aus Primärkulturen menschlicher Pulpa gewonnen wurden. Dentinmatrixproteine (eDMP) wurden nach etabliertem Protokoll extrahiert und aufkonzentriert (Widbiller et al. Int Endod J 2017). Beide Zelltypen wurden mit eDMP kultiviert, um die odontogene Differenzierung zu induzieren sowie mit osteogenem Differenzierungsmedium (StemPro™). Morphologische Veränderungen wurden nach 7 Tagen durch Fluoreszenzbildgebung nach DAPI- und Phalloidin-Färbung zur Visualisierung der Zellkerne und des Aktinzytoskeletts dokumentiert. Die Expression von Genen, die mit der Dentinogenese und der Proliferation in Zusammenhang stehen (COL1A1/IBSP/BGLAP/BMP4/TGFB1/NES/GPX3/IGFBP2/S100A4), wurde mittels quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) nach 1, 7 und 14 Tagen untersucht (n=4). Die Mineralisierungskapazität der Zellen wurde nach 21 Tagen mittels Alizarinrot-Färbung beurteilt. Die Daten wurden mit nichtparametrischen Tests (Mann-Whitney U) auf einem Signifikanzniveau von α = 0,05 analysiert.

Ergebnisse: Isolierte HAEC exprimierten sowohl mesenschymale als auch epitheliale Oberflächenantigene (CD49f>CD105>CD44>CD326), aber weder morphologische Veränderungen noch eine erhöhte Expression von differenzierungsbezogenen Genen wurden während der Kulturzeit beobachtet. Im Gegensatz zu DPSC, die sich unter osteogenen und odontogenen Kulturbedingungen differenzierten und mineralisierten, zeigten HAEC nur nach induzierter osteogener Differenzierung Kalzifizierung.

Schlussfolgerung: Insgesamt scheinen HAEC nicht in einen odontogenen, mineralisierenden Phänotyp zu differenzieren, was sie zu einer ungeeigneten Zellquelle für regenerative endodontische Ansätze macht.

Translation of the abstract (English)

Objectives: The aim of regenerative endodontics is to replace damaged pulp tissue and restore its biological function. Transplantation of multipotent dental pulp stem cells (DPSC) may facilitate pulp-like tissue formation, however, their availability is limited. Therefore, we aimed to investigate the use of pluripotent human amniotic epithelial cells (HAEC), which can be obtained in large numbers from the placenta, as an alternative stem cell source.

Methods: HAEC were isolated from placentas by trypsinization of the amniotic membrane and characterized by flow cytometry (CD44/CD49f/CD105/CD326), whereas DPSC were obtained from primary cultures of human pulp after magnetic-activated cell sorting (STRO-1). Dentine matrix proteins (eDMP) were extracted and concentrated as previously described (Widbiller et al. Int Endod J 2017). Both cell types were cultured with eDMP to induce odontogenic differentiation, with osteogenic differentiation medium (StemPro™) to promote osteogenic lineage commitment and with 10% fetal bovine serum as a control. Morphological changes were documented after 7 days by fluorescence imaging after DAPI and phalloidin staining to visualize cell nuclei and the actin cytoskeleton. Expression of genes related to dentinogenesis and proliferation (COL1A1/IBSP/BGLAP/BMP4/TGFB1/NES/GPX3/IGFBP2/S100A4) was investigated by reverse transcriptase quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) after 1, 7 and 14 days (n=4). The mineralization capacity was assessed by alizarin red staining after 21 days. Data were analysed by nonparametric tests (Mann-Whitney U) at an α = 0.05 level of significance.

Results: Isolated HAEC expressed all surface antigens (CD49f>CD105>CD44>CD326), but neither morphological changes nor an increased expression of differentiation-related genes were observed during the culture period. In contrast to DPSC, which differentiated and mineralized under osteogenic and odontogenic culture conditions, HAEC only showed calcification after induced osteogenic differentiation.

Conclusion: Overall, HAEC appear to not differentiate into an odontogenic, mineralizing phenotype, which makes them an unsuitable cell source for regenerative endodontic approaches.

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