Tumor development and progression are decisively affected by the immune system, especially by T cells. Tumors develop strategies to evade T cell rejection and concomitantly promote suppression of T cell responses. Despite growing knowledge, the underlying mechanisms are not completely understood. Unraveling these phenomena is important for the development of efficient immunotherapies against cancer. Previous work by Dr. Xydia in our group suggested a pro-tumorigenic role of the cytokine Interleukin-32 (IL-32) in breast cancer patients. Single-cell RNA-Sequencing revealed that IL-32 is highly upregulated in intratumoral immunosuppressive regulatory T cells (Treg) and in a subset of circulating tumor antigen (TA)-specific effector T cells (Teff) with tumor-promoting properties.
IL-32 has isoform-specific and context-dependent functions in viral infections, autoimmune diseases but also in cancer. However, the role of IL-32 in anti-tumor T cell immunity has been poorly investigated. Here, it was hypothesized that T cells upregulate specific IL-32 isoforms after their activation through tumor cell recognition, leading to the inhibition of Teff and the enhancement of Treg functions, and thereby a direct and indirect regulation of anti-tumor T cell responses. In this thesis, I could unravel that the IL-32β isoform is upregulated by a broad variety of T cells after T cell receptor (TCR) activation and IL-2 exposure. In tumor patients and healthy donors, CD4+ cells, in particular Th1 and Treg, were the major T cell source of IL-32β production. The secretion of IL-32β proteins by T cells was initiated after TCR activation and occurred through unconventional secretion pathways including secretory vesicles. The extracellular presence of IL-32β did not considerably affect the Th1 and Treg phenotype or their function. In contrast, IL-32β exerted an inhibitory impact on the effector function of CD8+ T cells. Specifically, IL-32β impaired the cytotoxic capacity of antigen-specific CD8+ Teff cells by diminishing their secretion of pro-inflammatory molecules, thereby inhibiting T cell-mediated tumor cell eradication. The immunosuppressive role of IL-32β was confirmed through a CRISPR/Cas9-mediated knock-out (KO) of IL-32 in antigen-specific CD8+ Teff cells, which resulted in elevated secretion levels of cytotoxic molecules and improved tumor cell eradication. The superior effector responses of IL-32KO CD8+ Teff cells were associated with higher glycolytic metabolism and enhanced TCR downstream signaling. Thus, IL-32β displays a potential target for future immunotherapeutic approaches to treat cancer patients.

Die Entstehung und Entwicklung von Tumoren werden maßgeblich durch das Immunsystem beeinflusst, wobei insbesondere T-Zellen eine wichtige Rolle spielen. Tumore entwickeln Strategien, um der Abstoßung durch T-Zellen zu entgehen und gleichzeitig suppressive T-Zell-Reaktionen zu fördern. Trotz wachsender Erkenntnisse sind die zugrundeliegenden Mechanismen noch nicht vollumfänglich verstanden. Die Aufklärung dieser Phänomene ist allerdings von großer Bedeutung, um effiziente Immuntherapien gegen Krebs zu entwickeln. Bisherige Forschungsergebnisse von
Dr. Xydia in unserer Arbeitsgruppe deuteten darauf hin, dass das Zytokin Interleukin-32 (IL-32) bei Brustkrebspatientinnen eine tumorfördernde Rolle spielt. Durch Einzelzell-RNA-Sequenzierungen konnte gezeigt werden, dass die Expression von IL-32 in intratumoralen immunsuppressiven regulatorischen T-Zellen (Treg) und in einer Untergruppe von zirkulierenden Tumorantigen-spezifischen Effektor T-Zellen (Teff) mit tumorfördernden Eigenschaften hochreguliert wurde. IL-32 hat isoformspezifische und kontextabhängige Funktionen bei Virusinfektionen, Autoimmun-erkrankungen und auch bei Krebs. Bislang wurde die Rolle von IL-32 in der T-Zell-Immunität im Kontext von Krebs jedoch kaum untersucht. In der vorliegenden Arbeit wurde die Hypothese aufgestellt, dass T-Zellen nach ihrer Aktivierung durch die Erkennung von Tumorzellen die Expression von IL-32 induzieren, was zur Hemmung von Teff- und zur Verstärkung der Treg-Funktionen führt und damit einhergehend zu einer direkten und indirekten Regulierung von tumorgerichteten T-Zell-Antworten. Bei der Bearbeitung dieser Hypothese konnte ich herausfinden, dass eine Vielzahl von verschiedenen T-Zell-Subgruppen die IL-32β-Isoform nach T-Zell-Rezeptor (TZR)-Aktivierung und IL-2-Exposition hochregulieren. In Tumorpatient*innen als auch in gesunden Spender*innen waren CD4+ Zellen unter den T-Zellarten die Hauptproduzenten von IL-32. Innerhalb der CD4+ T-Zellen wiederum wiesen Th1 und Treg die höchsten Werte von IL-32β auf. Die Sekretion von IL-32β-Proteinen durch T-Zellen wurde nach der TZR-Aktivierung initiiert und erfolgte über unkonventionelle Sekretionswege einschließlich sekretorischer Vesikel. Das extrazelluläre IL-32β hatte keinen wesentlichen Einfluss auf die Phänotypen oder Funktionen von Th1- und Treg-Zellen. Im Gegensatz dazu inhibierte IL-32β die Effektorfunktionen von CD8+ T-Zellen beträchtlich. Genauer gesagt hemmte IL-32β die Sekretion proinflammatorischer Moleküle von Antigen-spezifischen CD8+ Teff Zellen und verringerte damit deren Kapazität, Tumorzellen zu eliminieren. Diese immunsuppressive Rolle von IL-32β wurde durch einen CRISPR/Cas9-vermittelten Knock-Out (KO) von IL-32 in Antigen-spezifischen CD8+ Teff Zellen bestätigt. IL-32KO CD8+ Teff Zellen sezernierten höhere Mengen an zytotoxischen Molekülen, was folglich in einer verbesserten Tumorzell-Eradikation resultierte. Die gesteigerte Funktionalität der IL-32KO CD8+ Teff Zellen war mit einem höheren glykolytischen Metabolismus und einer verstärkten nachgeschalteten TCR-Signalgebung verbunden. Damit stellt IL-32β ein potenzielles Ziel für zukünftige immuntherapeutische Ansätze zur Behandlung von Krebspatient*innen dar.