Das Ergebnis der Transkription wird nicht nur durch die Wirkung eines einzelnen DNA-bindenden Transkriptionsfaktors (TF) bestimmt, sondern vielmehr durch das Zusammenspiel mehrerer TF und Enzyme untereinander und deren kombinatorischen Wechselwirkungen mit DNA (Lambert et al., 2018; Bondos und Tan, 2001; Howard und Davidson, 2004). Somit interagieren TF nicht nur mit DNA, sondern besitzen auch ...
Abstract (German)
Das Ergebnis der Transkription wird nicht nur durch die Wirkung eines einzelnen DNA-bindenden Transkriptionsfaktors (TF) bestimmt, sondern vielmehr durch das Zusammenspiel mehrerer TF und Enzyme untereinander und deren kombinatorischen Wechselwirkungen mit DNA (Lambert et al., 2018; Bondos und Tan, 2001; Howard und Davidson, 2004). Somit interagieren TF nicht nur mit DNA, sondern besitzen auch die Fähigkeit die Biologie anderer Proteine zu beeinflussen.
Durch vorangegangene Arbeiten konnte gezeigt werden, dass der myeloische
Master TF PU.1 mit einzelnen Enzymen der SWI/SNF-Familie, einschließlich BRG1(codiert durch SMARCA4), interagieren kann (Minderjahn et al., 2020). Die genauen Mechanismen, wie die Interaktion zwischen PU.1 und BRG1 funktioniert und welche Auswirkungen es für die Biologie von PU.1 hat, ist noch nicht abschließend geklärt. Um dies genauer zu untersuchen, sind geeignete Modellsysteme notwendig, die unter anderem im Rahmen dieser Dissertation erarbeitet wurden. Als Modell diente dabei die bereits gut untersuchte T-Zell Leukämie Zelllinie CTV-1, welche PU.1 endogen nicht exprimiert. Zur visuellen Unterscheidung wurde im ersten Teil der Arbeit mittels Klonierungsexperimenten eine Auswahl an fluoreszierenden PU.1-Fusionsproteinen (FP) erstellt. Eine Validierung der Proteine erfolgte vorab über mRNA-Transfektionsexperimente. Um einen späteren Farbunterschied bei den beteiligten Proteinen zu generieren, wurden verschieden farbig fluoreszierende Fusionsproteine (FFP) designt und mittels Durchflusszytometrie (FACS) mit dem verstärkt grün fluoreszierenden Protein (enhanced Green Fluorescent Protein; eGFP) in Bezug auf Intensität und Stabilität verglichen. Diese Analysen ergaben die Überlegenheit von GFP gegenüber den selbst designten Konstrukten. Um aus sterischer Sicht ein möglichst stabiles FP zu generieren, wurden anhand weiterer FACS-Analysen verschiedene Linker Varianten analysiert und verglichen, wobei der flexible Linker (FL) gegenüber dem 2A-Peptid (P2A) zu bevorzugen ist. Der zweite
Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Etablierung einer genetischen Manipulation im Genlocus BRG1 unter Zuhilfenahme des CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 Systems. Die On-target Effizienz wurde anhand eines T7-Endonuklease-I-Assay (T7EI) ermittelt und die BRG1-Proteinexpression in transfizierten CTV-1-Zellen mittels Western Blot (WB) unter Verwendung von AntiBRG1-Antikörpern analysiert. Sowohl die Abschätzung der genommodifizierenden Effizienz, als auch die BRG1-Proteinexpression nach CRISPR/Cas9-vermittelter Genom-Editierung sind vielversprechend. In Summe dient diese Arbeit der Erarbeitung von in vitro Modellen zur genaueren Untersuchung von Transkriptionsfaktoren und ihren assoziierten Proteinen und trägt somit zu einem besseren Verständnis des Zusammenspiels zwischen ihnen bei.
Translation of the abstract (English)
The outcome of transcription is not solely determined by the action of a single DNA-binding transcription factor (TF), but rather by the interplay of multiple TFs and other enzymes and their combinatorial interactions with DNA (Lambert et al., 2018; Bondos and Tan, 2001; Howard and Davidson, 2004). Thus, TFs not only interact with DNA but also possess the ability to influence the biology of other ...
Translation of the abstract (English)
The outcome of transcription is not solely determined by the action of a single DNA-binding transcription factor (TF), but rather by the interplay of multiple TFs and other enzymes and their combinatorial interactions with DNA (Lambert et al., 2018; Bondos and Tan, 2001; Howard and Davidson, 2004). Thus, TFs not only interact with DNA but also possess the ability to influence the biology of other enzymes.
Previous work has shown that the myeloid master TF PU.1 is able to interact with individual components of chromatin remodeling complexes of the SWI/SNF family, including BRG1 (encoded by SMARCA4) (Minderjahn et al., 2020). The exact mechanisms of how the interaction between PU.1 and BRG1 works and the impact it plays on the biology of PU.1 is not conclusively understood yet. To perform further investigations on this topic, suitable model systems were developed in this thesis. The well-studied T-cell leukemia cell line CTV-1, which does not endogenously express PU.1, served as a model. In the first part of this thesis, for visual differentiation, a selection of fluorescent PU.1 fusion proteins (FP) was generated using cloning experiments. Validation of the proteins was carried out in advance via mRNA transfection experiments. To generate a subsequent color difference in the proteins involved, different colored fluorescent fusion proteins (FFP) were designed and compared by flow cytometry (FACS) with the already well-studied eGFP in terms of intensity and stability. This analysis revealed the superiority of GFP over the self-designed constructs. In order to generate the most stable FP and to minimize steric hindrance, further FACS analyses were used to analyze and compare different linker variants, with the FL being preferred over P2A. The second part of the work serves to establish a genetic manipulation in the gene locus of BRG1 by using the CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 system. On-target efficiency was determined via T7 Endonuclease I assay (T7EI) and BRG1 protein expression was analyzed in transfected CTV-1 cells by Western Blot (WB) using anti-BRG1 antibodies. Both, the estimation of genome-modifying efficiency and BRG1 protein expression after CRISPR/Cas9-mediated genome editing, are promising. In summary, this work serves to elaborate in vitro models for a more detailed study of TFs and their associated proteins, thus contributing to a better understanding of the interplay between them.
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