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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-552967
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.55296
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 23 January 2024 |
| Referee: | Prof. Dr. Christian Wetzel |
| Date of exam: | 18 December 2023 |
| Institutions: | UNSPECIFIED |
| Keywords: | TSPO; knockout; CRISPR/Cas9; hiPSC; astrocyte; neuron; mitochondrial metabolism; respiration; OXPHOS; neurosteroid synthesis; cholesterol; mitochondrial membrane potential; calcium homeostasis; oxidative stress, cell size; VDAC1 |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 500 Natural sciences & mathematics 500 Science > 570 Life sciences 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 55296 |
Abstract (English)
The translocator protein 18 kDa (TSPO), initially characterised in 1977 as a peripheral binding receptor for benzodiazepines, is an evolutionarily conserved outer mitochondrial protein ubiquitously expressed in almost all cell types, albeit in a tissue- and cell-specific manner. Physiological expression within the brain is relatively weak. However, pathological conditions, such as Alzheimer’s ...
Abstract (English)
The translocator protein 18 kDa (TSPO), initially characterised in 1977 as a peripheral binding receptor for benzodiazepines, is an evolutionarily conserved outer mitochondrial protein ubiquitously expressed in almost all cell types, albeit in a tissue- and cell-specific manner. Physiological expression within the brain is relatively weak. However, pathological conditions, such as Alzheimer’s disease, multiple sclerosis, and cancer, can lead to upregulated TSPO expression, implying a role for TSPO in the pathophysiology of neurodegenerative, neuroinflammatory, and neoplastic diseases (Ammer et al., 2020; Rupprecht et al., 2010). Although TSPO is considered a multifunctional protein associated with various aspects of mitochondrial physiology, its precise role in mitochondrial homeostasis and its mechanisms of action remain elusive.
This study aimed to analyse the effect of TSPO on the regulation of mitochondrial metabolism in a human cellular model. Therefore, using the CRISPR/Cas9 technology, TSPO knockout (KO) and control (CTRL) variants of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), reprogrammed from primary adult skin fibroblasts, were generated.
In a multimodal phenotyping approach, parameters of cellular and mitochondrial functions were investigated and compared in neural progenitor cells, astrocytes, and neurons differentiated from hiPSC CTRL and KO cell lines. In those different cell types, the bioenergetic profile, as well as the mitochondrial membrane potential (MMP) and the Ca2+ homeostasis was assessed. Furthermore, oxidative stress, mitochondrial content, and cell size were evaluated.
Functional characterisation of TSPO KO cells, as compared to CTRL cells, revealed altered Ca2+ levels in the cytosol and mitochondria, a depolarised MMP, and increased levels of reactive oxygen species (ROS), indicating an unbalanced redox state and oxidative stress. While the mitochondrial content seemed to be unchanged, the mitochondrial DNA copy number was significantly decreased in mitochondria devoid of TSPO. Notably, TSPO deficiency was accompanied by reduced expression of the voltage-dependent anion channel (VDAC). Respirometry experiments favoured the possible role of TSPO in regulating the bioenergetic status of the cell, as mitochondrial respiration and glycolysis were significantly reduced along with the deletion of TSPO protein expression. Interestingly, across all cell types, TSPO-KO cells were significantly smaller in size.
Moreover, a significant decrease in the protein expression of TSPO and the TSPO-associated protein VDAC1 in a human cellular model of depression was observed, suggesting a potential link between TSPO and the pathomechanism of mitochondrial dysfunction in depression.
Taken together, these findings point consistently towards the impairment of mitochondrial function in TSPO KO cells, contributing to the understanding of the multifaceted role of TSPO and setting the stage for further investigations to unravel the underlying mechanisms and its involvement in various physiological and pathological processes.
Translation of the abstract (German)
Das Translokatorprotein 18 kDa, erstmals 1977 als peripherer Benzodiazepin-Rezeptor beschrieben, ist ein evolutionär konserviertes Protein der äußeren Mitochondrienmembran. Obwohl ubiquitär in allen Geweben exprimiert, variieren die Expressionslevel gewebe- und zellspezifisch. Die physiologische Expression im Gehirn ist vergleichsweise schwach. Neurodegenerative, neuroinflammatorische, sowie ...
Translation of the abstract (German)
Das Translokatorprotein 18 kDa, erstmals 1977 als peripherer Benzodiazepin-Rezeptor beschrieben, ist ein evolutionär konserviertes Protein der äußeren Mitochondrienmembran. Obwohl ubiquitär in allen Geweben exprimiert, variieren die Expressionslevel gewebe- und zellspezifisch. Die physiologische Expression im Gehirn ist vergleichsweise schwach. Neurodegenerative, neuroinflammatorische, sowie neoplastische Erkrankungen können jedoch einen pathologischen Anstieg der TSPO-Expression zur Folge haben, was auf eine TSPO-spezifische Rolle in der Pathophysiologie dieser Krankheiten hinweist. Wenngleich TSPO als Schlüsselprotein funktional mit verschiedenen Aspekten des mitochondrialen Metabolismus in Verbindung gebracht wird, sind die genauen Funktionen und Wirkmechanismen von TSPO weiterhin unklar.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte der Einfluss von TSPO auf die Regulation des mitochondrialen Metabolismus in einem humanen Zellmodell analysiert werden. Dazu wurde ein CRISPR/Cas9-vermittelter TSPO-Knockout in hiPSCs generiert, die aus primären adulten Fibroblasten reprogrammiert wurden. Um eine multimodale Analyse eines klar definierten TSPO-defizienten Phänotyps in verschiedenen Zellarten zu ermöglichen, wurden neurale Vorläuferzellen, Astrozyten und Neurone aus TSPO-Knockout und Kontroll-Stammzellen differenziert. Es wurde das bioenergetische Profil, sowie das MMP und die Ca2+ Homöostase untersucht. Zudem wurden ROS Level, Mitochondriengehalt und die Zellgröße analysiert.
Die funktionale Charakterisierung der TSPO-KO Zellen zeigte im Vergleich zu Kontroll-Zellen veränderte mitochondriale und zytosolische Ca2+-Spiegel, ein depolarisiertes MMP und Hinweise auf oxidativen Stress innerhalb der Zellen. Während die Anzahl an Mitochondrien unverändert erschien, konnte eine verringerte mitochondriale DNA copy number in Mitochondrien ohne TSPO beobachtet werden. Zudem, ging der Verlust der TSPO-Expression mit einer verringerten Expression des spannungsabhängigen Anionenkanals VDAC1 einher.
Respirometrische Analysen lassen eine mögliche modulatorische Rolle von TSPO auf den bioenergetischen Status der Zelle vermuten, da die mitochondriale Atmung, sowie die Glykolyse in Folge der TSPO-Deletion nachweislich reduziert waren. Interessanterweise waren die Knockout-Zellen aller untersuchten Zelltypen deutlich kleiner.
Darüber hinaus wurde eine signifikante Abnahme der Proteinexpression von TSPO und des TSPO-assoziierten Proteins VDAC1 in einem zellulären humanen Depressionsmodel beobachtet, was auf eine mögliche Verbindung zwischen TSPO und den Pathomechanismen von mitochondrialer Dysfunktion bei Depression hindeuten könnte.
Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse auf eine Beeinträchtigung der mitochondrialen Funktion in TSPO-KO-Zellen hin. Dies trägt zum besseren Verständnis der vielschichtigen Rolle von TSPO bei und bildet eine Grundlage für weitere Untersuchungen, um die zugrunde liegenden Mechanismen und die Beteiligung von TSPO an verschiedenen physiologischen und pathologischen Prozessen aufzuklären.
Metadata last modified: 23 Jan 2024 12:08
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