Development of a NADylated RNA Capture Method

Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Open Access Type:	Primary Publication
Date:	7 August 2024
Referee:	Prof. Dr. Gunter Meister
Date of exam:	15 July 2024
Institutions:	Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Biochemie I > Prof. Dr. Gunter Meister
Keywords:	NADylated RNA; NAD-RNA; deNADding; non-canonical cap; aptamer
Dewey Decimal Classification:	500 Science > 500 Natural sciences & mathematics 500 Science > 570 Life sciences
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	58712

Abstract (English)

The 7-methylguanosine cap structure protects the 5’-end of most cellular RNAs and plays a crucial role in post-transcriptional gene regulation. Nucleotide-containing coenzymes have been discovered to be covalently linked to the 5’-end of RNA, but the biological roles of these so-called “non-canonical caps” are still unclear. The identification of RNAs modified with nicotinamide adenosine ...

Abstract (English)

The 7-methylguanosine cap structure protects the 5’-end of most cellular RNAs and plays a crucial role in post-transcriptional gene regulation. Nucleotide-containing coenzymes have been discovered to be covalently linked to the 5’-end of RNA, but the biological roles of these so-called “non-canonical caps” are still unclear. The identification of RNAs modified with nicotinamide adenosine dinucleotide (NAD) has been possible by the development of specific capture methods for NADylated RNAs. However, these protocols rely heavily on the prior modification of the NAD moiety, and thus are associated with several limitations and biases. This thesis explored two new approaches to directly target the 5’-NAD structure. On the one hand, we attempted to generate antibodies recognizing the NAD cap. However, we were unsuccessful in identifying candidates suitable for NADylated RNAs enrichment. On the other hand, we used NAD- and NMN-binding aptamers to enrich NADylated RNAs. This capture approach can be combined to a decapping step in order to increase the specificity of the enrichment. To this end, we expressed and purified the human deNADding enzyme Nudt12. Nudt12-treatment of NADylated RNAs yields monophosphorylated RNAs that can directly be ligated to an adapter and used for library preparation and sequencing. Although our capture-decapping approach still requires further optimization before in vivo applications, it expands the toolbox of methods for capturing NADylated RNAs by offering a previously unavailable alternative: directly binding the NAD modification.

Translation of the abstract (German)

Die 7-Methylguanosin-Kappenstruktur schützt das 5'-Ende der meisten zellulären RNAs und spielt eine entscheidende Rolle bei der posttranskriptionellen Genregulation. Es wurde entdeckt, dass nukleotidhaltige Coenzyme kovalent an das 5'-Ende von RNA gebunden sind, aber die biologische Rolle dieser so genannten „nicht-kanonischen Kappen“ ist noch unklar. Die Identifizierung von RNAs, die mit ...

Translation of the abstract (German)

Die 7-Methylguanosin-Kappenstruktur schützt das 5'-Ende der meisten zellulären RNAs und spielt eine entscheidende Rolle bei der posttranskriptionellen Genregulation. Es wurde entdeckt, dass nukleotidhaltige Coenzyme kovalent an das 5'-Ende von RNA gebunden sind, aber die biologische Rolle dieser so genannten „nicht-kanonischen Kappen“ ist noch unklar. Die Identifizierung von RNAs, die mit Nikotinamid-Adenosin-Dinukleotid (NAD) modifiziert sind, wurde durch die Entwicklung spezifischer Fangmethoden für NADylierte RNAs ermöglicht. Diese Protokolle sind jedoch in hohem Maße von der vorherigen Modifizierung des NAD-Teils abhängig und daher mit verschiedenen Einschränkungen und Verzerrungen verbunden. In dieser Arbeit wurden zwei neue Ansätze untersucht, um die 5'-NAD-Struktur direkt zu erfassen. Zum einen haben wir versucht, Antikörper zu entwickeln, die die NAD-Kappe erkennen. Es gelang uns jedoch nicht, geeignete Kandidaten für die Anreicherung NADylierter RNAs zu finden. Andererseits haben wir NAD- und NMN-bindende Aptamere verwendet, um NADylierte RNAs anzureichern. Dieser Capture-Ansatz kann mit einem Decapping-Schritt kombiniert werden, um die Spezifität der Anreicherung zu erhöhen. Zu diesem Zweck haben wir das menschliche deNADding-Enzym Nudt12 exprimiert und gereinigt. Die Nudt12-Behandlung von NADylierten RNAs führt zu monophosphorylierten RNAs, die direkt an einen Adapter ligiert und für die Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung verwendet werden können. Obwohl unser Capture-Decapping-Ansatz vor der Anwendung in vivo noch weiter optimiert werden muss, erweitert er das Instrumentarium der Methoden zum Capturing NADylierter RNAs um eine bisher nicht verfügbare Alternative: die direkte Bindung der NAD-Modifikation.

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