Um die Therapie des metastasierten Malignen Melanoms zu verbessern, wird am Lehrstuhl für experimentelle Medizin und Therapieverfahren der Universität Regensburg die Metastasierung in den Wächterlymphknoten (SLN) untersucht. Mittels der MCSP-Immunfluoreszenzfärbung von Einzelzellsuspensionen der SLN werden dabei Einzelzellen aus den SLN isoliert, um die Genexpression der Zellen analysieren zu können. Das Ziel dieser Arbeit war, disseminierte Melanomzellen anhand ihrer Genexpression zu identifizieren. Hierfür lag eine Probenbank aus MCSP-positiven Zellen aus SLN von über 400 Patienten vor. In den SLN war der Anteil der MCSP-positiven Zellen sehr unterschiedlich mit einem Median von 5 MCSP-positiven Zellen pro Million untersuchter Zellen (DCCDMCSP), und einer Range von 0-400000. In Lymphknoten tumorfreier Patienten (CLN) war der Median 4 und die Range 0-15. Die MCSP-Immunfluoreszenz detektierte also nicht spezifisch Melanomzellen. Gesehen wurden große, intensiv angefärbte und kleine, meist weniger intensiv angefärbte Zellen. Die CLN-Zellen waren alle klein und schwach gefärbt. Es gab einen Zusammenhang zwischen hoher DCCDMCSP und dem Vorkommen großer MCSP-positiver Zellen. Aus Vorarbeiten war bekannt, dass sowohl große als auch kleine MCSP-positive Zellen Melanomzellen sein konnten. Eine Entwicklung der disseminierten Zellen von kleinen zu großen MCSP-positiven Zellen wurde angenommen. In Endpunkt-PCR-Untersuchungen konnte festgestellt werden, dass die Co-Expression der drei Differenzierungsmarker Melan-A, gp100 und TRP2 ein Merkmal der großen MCSP-positiven Zellen darstellte, das in CLN-Zellen nicht vorhanden war. Einige kleine MCSP-positive Zellen zeigten dieses Merkmal ebenfalls. Auf Grundlage von Genexpressionsmikroarraydaten wurde MelanA als potenzieller Marker zur Identifizierung von Melanomzellen ausgewählt. Es konnte eine qPCR zur Detektion von MelanA etabliert werden. Durch die mögliche Quantifizierung der Genexpression wurde gezeigt, dass MelanA in CLN-Zellen nicht relevant exprimiert wird, dafür in sehr hohem Maße in großen MCSP-positiven Zellen. Einige kleine MCSP-positive Zellen hatten auch starke MelanA-Expression. Die in qPCR MelanA-positiven Zellen wurden als Melanomzellen definiert. Die kombinierte Auswertung mit Patientendaten des Regensburger Tumorzentrums zeigte, dass der qPCR-Nachweis von MelanA in Einzelzellen aus SLN, egal ob in kleinen oder großen MCSP-positiven Zellen, einen negativen prognostischen Einfluss auf das Patientenüberleben hatte. Durch die Kombination der MelanA-qPCR-Ergebnisse mit der Breslow-Tumordicke oder dem histopathologischen Lymphknotenstatus konnten Patienten mit besonders hohem Risiko definiert werden. Der Einfluss der MelanA-qPCR wurde durch eine multivariate Analyse mit weiteren bekannten Risikofaktoren für eine ungünstige Prognose bestätigt. Ein bereits publiziertes Prädiktionsmodell konnte somit verbessert werden. Die Kenntnis von Risikopatienten könnte als Risikostratifizierung genutzt werden und in klinische Studien zur Therapieverbesserung einfließen.

To improve melanoma therapy the Chair of Experimental Medicine and Therapy Research investigates metastases in sentinel lymph nodes (SLN). Single cell suspensions were derived from SLN. Single cells are isolated using immunofluorescence targeting MCSP (Melanoma-associated Chondroitin Sulfate Proteoglycan). Their gene expression is analyzed. This dissertation aimed to identify disseminated melanoma cells using gene expression analysis. MCSP-positive cells from SLN of more than 400 patients were available. In SLN the rate of MCSP-positive cells per million screened cells (DCCDMCSP) varied greatly with a median of 5 and a range from 0 - 400000 cells. In lymph nodes of tumor-free patients (control lymph nodes, CLN) the median was 4 and the range 0 - 15 cells. Therefore, MCSP-immunofluorescence was not exclusive to melanoma cells. We saw larger, more intensively stained and smaller, less intensively stained cells. All of the CLN-cells were of the second kind. A positive correlation existed between high DCCDMCSP and large MCSP-positive cells. Preliminary studies of MCSP-positive cells showed melanoma cells of both morphologies. We assumed an evolution from small to large cells. Endpoint-PCR-analysis revealed a co-expression of the three melanoma marker genes Melan-A, gp100 and TRP2 as a characteristic trait of the large MCSP-positive cells that was not found in CLN-cells. Some small MCSP-positive cells did also show threefold expression. Based on results from gene expression microarrays we picked Melan-A as a potential marker to identify melanoma cells. A qPCR was established that enabled quantification of the gene expression. CLN-cells did not show relevant expression of Melan-A whereas in large MCSP-positive cells it was very common. Some small MCSP-positive cells had high expression of Melan-A as well. Cells with Melan-A expression detected with qPCR were defined as Melanoma cells. Combined analysis with clinical data showed negative prognostic impact of Melan-A expression regardless of MCSP-cell morphology. Combined analysis of Breslow's tumor thickness or pathologic lymph node status and Melan-A expression defined patients with especially high risk. The impact of Melan-A expression was also assessed by multivariate analysis including known risk factors for bad prognosis. A previously published prediction model was thereby improved. Information about high risk patients could be used for stratification in clinical studies and should be further investigated.