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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-594371
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.59437
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 28 October 2024 |
| Referee: | Prof. Dr. Bernhard Weber |
| Date of exam: | 23 October 2024 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Humangenetik |
| Keywords: | Morbus Best, BVMD, BEST1, Bestrophin, CRISPR/Cas9, nonsense-mediated decay, AAV-Vektor, SNP |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 59437 |
Abstract (German)
Das Bestrophin (BEST1) ist ein integrales Membranprotein, das okulär exklusiv in der basolateralen Zellmembran des retinalen Pigmentepithels (RPE) des Menschen liegt und dort als Kalzium-aktivierter Chlorid-Kanal fungiert. Für das BEST1- Gen sind bisher über 250 Mutationen bekannt, die zu verschiedenen seltenen hereditären Netzhauterkrankungen, den sogenannten Bestrophinopathien, führen. Unter ...
Abstract (German)
Das Bestrophin (BEST1) ist ein integrales Membranprotein, das okulär exklusiv in der basolateralen Zellmembran des retinalen Pigmentepithels (RPE) des Menschen liegt und dort als Kalzium-aktivierter Chlorid-Kanal fungiert. Für das BEST1- Gen sind bisher über 250 Mutationen bekannt, die zu verschiedenen seltenen hereditären Netzhauterkrankungen, den sogenannten Bestrophinopathien, führen. Unter diesen stellt die autosomal dominant vererbte Best’sche vitelliforme Makuladegeneration (BVMD) das häufigste Krankheitsbild dar, welches über eine schleichende Visus-Abnahme bis zum teilweisen Sehverlust führen kann. Obwohl der zugrunde liegende Pathomechanismus bereits in ersten Ansätzen aufgeklärt ist, gibt es für die BVMD noch keine effektiven Therapien. Heterozygote autosomal-dominante BEST1-Mutationen lassen auf einen dominant-negativen Effekt schließen, da bereits die Integration einer, vom mutierten Allel exprimierten, fehlerhaften Untereinheit in die Quartärstruktur die gesamte Kanalfunktion kompromittiert. Als Therapieansatz erscheint es deshalb sinnvoll, das mutierte Allel gezielt auszuschalten, sodass die BEST1-Expression allein über das wildtypische Allel erfolgt. Hierfür empfiehlt sich das CRISPR/Cas9-System, bei dem eine Cas9-Endonuklease von einer programmierbaren sgRNA sequenzspezifisch zum CIRSPR-Target auf der DNA geführt wird und einen Doppelstrangbruch induziert. In den postmitotischen RPE-Zellen wird durch die Reparaturmechanismen ein Frame-shift und ein frühzeitiges Stopp-Codon provoziert, das als Nonsense-Mutation die weitere Expression des mutierten Allels unterdrückt. Bei dem hier verfolgten Ansatz sollte das CRISPR/Cas9-vermittelte Stilllegen des mutierten BEST1-Allels Haplotyp-spezifisch durch das Adressieren definierter Nukleotidpolymorphismen (SNP) erfolgen. Für 22 geeignete und in der Population hochfrequente SNPs waren in Vorarbeiten bereits Guides entwickelt und Optimierungsversuchen unterzogen worden, um Effizienz und Spezifität ihrer CRISPR-Aktivität zu verbessern.
In dieser Arbeit sollte nun eine Optimierung der Cas9-Nuklease erfolgen, mit dem Ziel eine Verbesserung der Spezifität zu erreichen. Dazu wurden vier in der Literatur beschriebene, modifizierte Varianten der SpCas9 reproduziert, für die eine Verbesserung der Spezifität beschrieben war. Kombinationen aus SNP-spezifischen Guides und den Cas9-Konstrukten wurden anschließend in einem All-in-one-CRISPR-AAV-Vektor (miniAAV) mit verkürzten Promotoren in einem Zell-Fluoreszenz-Assay auf ihre CRISPR-Aktivität am ON- und OFF-Target der SNP-Varianten getestet. Die modifizierten Cas9- Konstrukte zeigten in den Versuchen eine eher geringe Effizienz und ihre Funktion wirkte stark beeinträchtigt, sowie in hohem Maße sgRNA-abhängig. Bei Versuchen am genomischen BEST1-Lokus verlor der miniAAV-Vektor deutlich an Effizienz. Für die viralen Transduktionen von HEK293T, Fibroblasten und hiPSC-RPE Zellen wurde deshalb auf eine alternative Transportmethode mit dualen AAV-Vektoren zurückgegriffen. Bei der Testung der dualen CRISPR-AAV-Vektoren in viral transduzierten HEK293T-Zellen wurde sgRNA-abhängig eine sehr unterschiedliche Effizienz der CRISPR/Cas9- Aktivitäten festgestellt. Die Transduktion von hiPSC-RPE-Zellen stellte sich als ineffizient dar.
Zusammenfassend erweisen sich die modifizierten Cas9-Varianten für den verfolgten Therapieansatz als ungeeignet. Der miniAAV-Vektor empfiehlt sich durch seine schwache Effizienz auf genomischer ebene ebenfalls nicht für eine virale Transduktion in RPE-Zellen, weshalb er durch die alternative Transportmethode der dualen AAV-Vektoren abgelöst wurde. In Zukunft wird anhand dieses Transportsystems eine umfassende Testung aller SNP-spezifischen sgRNAs und deren optimierter Varianten mit dem SpCas9-Enzym und dessen Varianten erforderlich sein, um für jeden targetierbaren SNP die optimale Kombination des CRISPR/Cas9-Systems zu ermitteln. Die entsprechenden CRISPR-AAV-Vektoren werden abschließend in Versuchen an hiPSC-abgeleiteten RPE-Zellen von BVMD-Patienten getestet werden müssen. Bevor ein praktischer Einsatz erwogen werden kann, ist außerdem eine umfassende Analyse auf OFF-Target-Effekte notwendig, zum Ausschluss ungewollter genomweiter Nebenwirkungen. Ausschlaggebend für einen Erfolg des Verfahrens wird sein, ob sich tatsächlich ein Knock-Out des mutierten Allels und eine Verbesserung des pathologischen Phänotyps erreichen lässt.
Translation of the abstract (English)
Bestrophin (BEST1) is an integral membrane protein located exclusively in the basolateral cell membrane of the human retinal pigment epithelium (RPE), where it functions as a calcium-activated chloride channel. To date, more than 250 mutations are known for the BEST1 gene, which lead to various rare hereditary retinal diseases, the so-called bestrophinopathies. The most common of these is the ...
Translation of the abstract (English)
Bestrophin (BEST1) is an integral membrane protein located exclusively in the basolateral cell membrane of the human retinal pigment epithelium (RPE), where it functions as a calcium-activated chloride channel. To date, more than 250 mutations are known for the BEST1 gene, which lead to various rare hereditary retinal diseases, the so-called bestrophinopathies. The most common of these is the autosomal dominant Best vitelliform macular degeneration (BVMD), which can lead to a gradual decrease in visual acuity and even partial loss of vision. Although the underlying pathomechanism has already been elucidated to some extent, there are still no effective therapies for BVMD. Heterozygous autosomal dominant BEST1 mutations suggest a dominant-negative effect, as even the integration of a defective subunit expressed by the mutant allele into the quaternary structure compromises the entire canal function. As a therapeutic approach, it therefore seems sensible to specifically switch off the mutated allele so that BEST1 expression occurs solely via the wild-type allele. For this purpose the CRISPR/Cas9 system is recommended, in which a Cas9 endonuclease is guided by a programmable sgRNA in a sequence-specific manner to the CIRSPR target on the DNA and induces a double-strand break. In the post-mitotic RPE cells, the repair mechanisms provoke a frame shift and an early stop codon, which suppresses further expression of the mutant allele as a nonsense mutation. In the approach pursued here, CRISPR/Cas9-mediated silencing of the mutant BEST1 allele should be haplotype-specific by addressing defined single nucleotide polymorphisms (SNP). For 22 suitable SNPs that are highly frequent in the population, guides had already been developed in preliminary work and subjected to optimization tests to improve the efficiency and specificity of their CRISPR activity.
The aim of this work was to optimize the Cas9 nuclease with the aim of improving specificity. For this purpose, four modified variants of SpCas9 described in the literature were reproduced, for which an improvement in specificity was described. Combinations of SNP-specific guides and the Cas9 constructs were then tested in an all-in-one CRISPR-AAV vector (miniAAV) with shortened promoters in a cell fluorescence assay for their CRISPR activity at the ON and OFF target of the SNP variants. The modified Cas9 constructs showed a rather low efficiency in the experiments and their function was strongly impaired and highly sgRNA-dependent. In experiments on the genomic BEST1 locus, the miniAAV vector clearly lost efficiency. For the viral transductions of HEK293T, fibroblasts and hiPSC-RPE cells, an alternative transport method with dual AAV vectors was therefore used. When testing the dual CRISPR-AAV vectors in virally transduced HEK293T cells, a very different efficiency of CRISPR/Cas9 activities was observed depending on the sgRNA. The transduction of hiPSC-RPE cells proved to be inefficient.
In summary, the modified Cas9 variants prove to be unsuitable for the therapeutic approach being pursued. Due to its low efficiency at the genomic level, the miniAAV vector is also not recommended for viral transduction in RPE cells, which is why it was replaced by the alternative transport method of dual AAV vectors. In the future, comprehensive testing of all SNP-specific sgRNAs and their optimized variants with the SpCas9 enzyme and its variants will be required using this transport system to determine the optimal combination of the CRISPR/Cas9 system for each targetable SNP. The corresponding CRISPR-AAV vectors will finally have to be tested in trials on hiPSC-derived RPE cells from BVMD patients. Before a practical application can be considered, a comprehensive analysis for OFF-target effects is also necessary to exclude unwanted genome-wide side effects. The decisive factor for the success of the procedure will be whether a knock-out of the mutated allele and an improvement in the pathological phenotype can be achieved.
Metadata last modified: 30 Oct 2024 09:40
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