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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-751129
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.75112
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 19 May 2025 |
| Referee: | Prof. Dr. Ralf Wagner and Prof. Dr. Annette Mankertz |
| Date of exam: | 31 March 2025 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene |
| Keywords: | Neutralization assay, measles virus, measles, immunity Neutralisationstest Masernvirus Masern Immunität |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 500 Natural sciences & mathematics 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 75112 |
Abstract (German)
Das Masernvirus ist ein humanpathogenes Paramyxovirus, welches vermutlich vom Rinderpestvirus der frühen Antike abstammt. Es ist hochkontagiös und löst bei Menschen die Masern aus, eine Erkrankung, welche mit schweren Komplikationen und Todesfällen einhergehen kann. Seit 1963, also 60 Jahren, ist ein wirksamer, sicherer und kostengünstiger Impfstoff verfügbar, welcher attenuierte, lebende ...
Abstract (German)
Das Masernvirus ist ein humanpathogenes Paramyxovirus, welches vermutlich vom Rinderpestvirus der frühen Antike abstammt. Es ist hochkontagiös und löst bei Menschen die Masern aus, eine Erkrankung, welche mit schweren Komplikationen und Todesfällen einhergehen kann. Seit 1963, also 60 Jahren, ist ein wirksamer, sicherer und kostengünstiger Impfstoff verfügbar, welcher attenuierte, lebende Masernviren des Stammes Edmonston enthält. Seit den 90er Jahren wird die regionale Elimination der endemischen Masern weltweit als Ziel der Staaten aller WHO-Regionen angestrebt. Durch die Einführung der Routineimpfung und ergänzende Impfaktivitäten wurden weltweit wesentliche Fortschritte zur Bekämpfung der Masern erreicht. Laut Schätzung der World Health Organization (WHO) konnten durch diese Impfungen im Zeitraum 2000-2021 mehr als 56 Millionen Todesfälle verhindert werden. Dennoch kommt es weltweit immer noch zu großen Masernausbrüchen, auch in Deutschland. Daher ist ein Schutz gegen Masern wichtig und es bestehen weiterhin verschiedenste Fragestellungen im klinischen Alltag.
Hierbei müssen auch Patienten und Patientinnen beachtet werden, die keinen Impfschutz aufbauen oder wegen vorliegender Kontraindikationen nicht geimpft werden können. Gerade wenn die Impfung mit Lebendviren ein gesundheitliches Risiko darstellt, sollten nach Kontakt zu Masernviren bei fehlendem Impfschutz Therapieoptionen sorgfältig abgewogen werden. Neben einer Impfpasskontrolle kann der Frage nach einer Immunität gegen Masern mittels ELISA-Verfahren nachgegangen werden. Hierbei werden IgG-Antikörper gegen das Masernvirus gemessen. Bei negativem Ergebnis aber, also im ELISA-Verfahren nicht nachweisbaren IgG-Antikörpern, kann ein Neutralisationstest, der FRNT, durchgeführt werden. Hierbei werden neutralisierende Antikörper gegen das Masernvirus im Blut gemessen. Selbst bei negativem ELISA kann ein positiver FRNT-Test Immunität und somit Schutz vor Erkrankung nachweisen. Die Messung neutralisierender Antikörper ist somit für Fragestellungen in Diagnostik und Forschung von großem Interesse. Der als Goldstandard verwendete FRNT wurde durch die WHO standardisiert und wird über fünf bis sechs Tage durchgeführt, eine Zeitspanne, welche im klinischen Alltag entscheidend sein kann. Gemessen wird der Titer neutralisierender Antikörper durch die Reduktion einer auf dem Zellrasen getesteten Virusinfektion mit Masernviren.
Mit einem alternativem Masernvirus-Neutralisationstest, genannt NT-qPCR, welcher durch Endpunktbestimmung mittels Polymerase Kettenreaktion (PCR) ausgewertet wird, würde sich die Laufzeit des Testes verkürzen.
Zu diesem Zweck wurde eine RT-qPCR etabliert. Die relative Quantifizierung wurde mit Hilfe von Masernvirus-RNA oder spezifisch hergestellter DNA-Fragmente als Standard durchgeführt. Der FRNT wurde mit den Masernvirus-Genotypen Edmonston wildtype (Genotyp A) und MVi/Offenburg.DEU/10.19 (Genotyp D8) eingestellt. Weiterhin wurde zur Endpunktbestimmung des Testes die Extraktion der Masernvirus-RNA oder die Lyse mit direkter Weiterverwendung des Lysates in der RT-qPCR verglichen. Die Neutralisationstiter wurden mittels linearer Regression, sowie mittels nicht-linearer Regression und gewählter dose-response-inhibition-curve berechnet. Alle NT-qPCRs wurden zunächst mit einer im ELISA IgG-positiv getesteten (20-00848) und einer IgG-negativ getesteten (20-00762) Probe durchgeführt, um Vergleichbarkeit über alle getesteten Varianten hinweg herzustellen. Als Referenz wurde in den NT-qPCRs mit beiden Erntevarianten, Extraktion und Lyse, der für den FRNT entwickelte 3. Internationale Standard der WHO, sowie käufliches Immunglobulin (KEDRION) mit bekanntem FRNT-Titer eingesetzt.
Diese Arbeit soll durch die Etablierung eines Neutralisationstestes mit Endpunktbestimmung mittels RT-qPCR wesentlich zum Übergang hin zu einer zeitnahen, quantitativen Bestimmung sero-protektiver Titer Masernvirus-neutralisierender Antikörper beitragen. Methodische Fragen und Details, welche durch weiterführende Experimente innerhalb eines Anschlussprojektes noch zu bearbeiten sind, werden aufgezeigt. Der NT-qPCR könnte im klinischen Alltag die Klärung eines Immunitäts-Status gegen Masernviren für gefährdete Patientengruppen erheblich beschleunigen und ein hilfreiches Instrument für Forschungsfragen sein.
Translation of the abstract (English)
The measles virus is a human pathogenic paramyxovirus, which is thought to have originated from the rinderpest virus of early antiquity. It is highly contagious and causes measles in humans, a disease that can be associated with serious complications and death. An effective, safe and inexpensive vaccine containing attenuated, live measles viruses of the Edmonston strain has been available since ...
Translation of the abstract (English)
The measles virus is a human pathogenic paramyxovirus, which is thought to have originated from the rinderpest virus of early antiquity. It is highly contagious and causes measles in humans, a disease that can be associated with serious complications and death. An effective, safe and inexpensive vaccine containing attenuated, live measles viruses of the Edmonston strain has been available since 1963, 60 years ago. Since the 1990s, the regional elimination of endemic measles worldwide has been the goal of countries in all WHO regions. Through the introduction of routine immunization and supplementary vaccination activities, significant progress has been made worldwide in the fight against measles. The World Health Organization (WHO) estimates that these vaccinations prevented more than 56 million deaths in the period 2000-2021. Nevertheless, there are still major measles outbreaks worldwide, including in Germany. Therefore, protection against measles is important and there are still various issues in everyday clinical practice.
Attention must also be paid to patients who have not been vaccinated or who cannot be vaccinated due to contraindications. Especially if vaccination with live viruses poses a health risk, treatment options should be carefully considered after contact with measles viruses in the absence of vaccination protection. In addition to a vaccination certificate check, the question of immunity to measles can be investigated using ELISA methods. This measures IgG antibodies against the measles virus. However, if the result is negative, i.e. IgG antibodies cannot be detected in the ELISA procedure, a neutralization test, the FRNT, can be carried out. In this test, neutralizing antibodies against the measles virus are measured in the blood. Even if the ELISA is negative, a positive FRNT test can prove immunity and thus protection against the disease. The measurement of neutralizing antibodies is therefore of great interest for questions in diagnostics and research. The FRNT used as the gold standard has been standardized by the WHO and is carried out over five to six days, a period of time that can be decisive in everyday clinical practice. The titer of neutralizing antibodies is measured by the reduction of a viral infection with measles viruses tested on the cell lawn.
With an alternative measles virus neutralization test, called NT-qPCR, which is evaluated by endpoint determination using polymerase chain reaction (PCR), the runtime of the test would be shortened.
RT-qPCR was established for this purpose. Relative quantification was performed using measles virus RNA or specifically prepared DNA fragments as a standard. The FRNT was set up with the measles virus genotypes Edmonston wildtype (genotype A) and MVi/Offenburg.DEU/10.19 (genotype D8). Furthermore, the extraction of measles virus RNA or lysis with direct further use of the lysate in RT-qPCR was compared to determine the endpoint of the test. The neutralization titres were calculated using linear regression and non-linear regression with a selected dose-response inhibition curve. All NT-qPCRs were initially performed with an ELISA IgG-positive sample (20-00848) and an IgG-negative sample (20-00762) in order to establish comparability across all tested variants. As a reference, the 3rd WHO International Standard developed for FRNT and commercial immunoglobulin (KEDRION) with a known FRNT titer were used in the NT-qPCRs with both harvest variants, extraction and lysis.
By establishing a neutralization test with endpoint determination using RT-qPCR, this work should contribute significantly to the transition to a timely, quantitative determination of sero-protective titres of measles virus neutralizing antibodies. Methodological questions and details, which still need to be addressed by further experiments within a follow-up project, are outlined. The NT-qPCR could considerably accelerate the clarification of immunity status against measles viruses for vulnerable patient groups in everyday clinical practice and be a helpful tool for research questions.
Metadata last modified: 19 May 2025 07:34
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