Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor of childhood, and the prognosis for patients with refractory or relapsed high-risk neuroblastoma remains dismal despite intensive multimodal therapy regimens. No established therapy protocols exist for heavily pre-treated patients in the case of relapse or treatment failure, and novel therapeutic options are urgently needed. The multimodal metronomically designed RIST therapy combines molecularly targeted drugs (rapamycin and dasatinib) with conventional chemotherapy (irinotecan and temozolomide) and has been evaluated in a clinical phase II trial (RIST-rNB-2011). The promising results of this trial have been submitted for publication at the time of this thesis publication. This study aimed to analyze whether the presence of a MycN amplification in neuroblastoma leads to a difference in responsiveness to the RIST therapy in an in vitro model of neuroblastoma. Secondly, this study aimed to gain a deeper understanding of the underlying molecular mechanisms and to identify previously unknown signaling pathways relevant to the RIST therapy.
RIST was shown to induce programmed cell death more efficiently in MycN-amplified (KELLY, LAN-5) than in MycN-non-amplified (SK-N-SH, SK-N-AS) neuroblastoma cell lines in apoptosis assays utilizing Annexin V- and propidium iodide staining followed by fluorescence-activated cell sorting analysis. In semiquantitative multiplex antibody arrays and based on the status of phosphorylation of defined target proteins, successful inhibition of key components within the PI3K/AKT/mTOR pathway, as well as activation of tumor suppressors, such as the phosphatase PTEN and the protein kinase GSK-3β, by RIST could be demonstrated. Furthermore, lower protein expression of the molecular chaperone HSP60 and lower activation of the tumor-promoting transcription factor CREB and the angiogenesis-stimulating protein kinase WNK were demonstrated after treatment with RIST. These effects of the RIST therapy were particularly evident in MycN-amplified neuroblastoma cell lines compared to MycN-non-amplified neuroblastoma cell lines. In contrast, inhibition of the Src kinase family appears to be independent of MycN status. The results presented here provide important insights into the molecular mechanisms of the RIST therapy and lay the groundwork for further follow-up studies urgently needed to improve therapy regimens for patients with refractory or relapsed high-risk neuroblastoma.

Das Neuroblastom ist der häufigste extrakranielle solide Tumor im Kindesalter. Die Prognose für Patienten mit refraktärem oder rezidiviertem Hochrisiko-Neuroblastom ist trotz intensiver multimodaler Therapieregime nach wie vor schlecht. Für intensiv vorbehandelte Patienten gibt es keine etablierten Therapieprotokolle für den Fall eines Rückfalls oder Therapieversagens, und es werden dringend neue therapeutische Optionen benötigt. Die multimodale, metronomisch angelegte RIST-Therapie kombiniert molekular zielgerichtete Medikamente (Rapamycin und Dasatinib) mit konventioneller Chemotherapie (Irinotecan und Temozolomid) und wurde in einer klinischen Phase-II-Studie (RIST-rNB-2011) untersucht. Die vielversprechenden Daten dieser klinischen Studie sind zum Zeitpunkt dieser Dissertation zur Veröffentlichung eingereicht worden. Ziel dieser Arbeit war es, in einem in vitro Modell des Neuroblastoms zu analysieren, ob eine MycN-Amplifikation zu einem Unterschied in der Ansprechbarkeit der RIST-Therapie führt. Zweitens zielte diese Arbeit darauf ab, ein tieferes Verständnis für die der RIST-Therapie zugrunde liegenden molekularen Mechanismen zu erlangen und bisher nicht bekannte therapierelevante Signalwege zu identifizieren.
In Apoptose-Assays mit Annexin V- und Propidiumiodid-Färbung und anschließender Fluorescence-Activated Cell Sorting-Analyse konnte gezeigt werden, dass RIST den programmierten Zelltod effizienter in MycN-amplifizierten (KELLY, LAN-5) als in MycN-nicht-amplifizierten (SK-N-SH, SK-N-AS) Neuroblastom-Zelllinien induziert. Durch RIST konnte in semiquantitativen Multiplex-Antikörper-Arrays, und basierend auf dem Status der Phosphorylierung definierter Zielproteine, eine erfolgreiche Hemmung von Schlüsselkomponenten innerhalb des PI3K/AKT/mTOR-Signalwegs sowie die Aktivierung von Tumorsuppressoren, wie der Phosphatase PTEN und der Proteinkinase GSK-3β, nachgewiesen werden. Weiterhin wurde durch RIST eine niedrigere Proteinexpression des molekularen Chaperons HSP60 und eine geringere Aktivierung des Tumor-fördernden Transkriptionsfaktors CREB sowie der Angiogenese-stimulierenden Proteinkinase WNK gezeigt. Diese Effekte der RIST-Therapie wurden insbesondere in MycN-amplifizierten Neuroblastom-Zelllinien im Vergleich zu MycN-nicht-amplifizierten Neuroblastom-Zelllinien deutlich, während die Hemmung der Src Kinase-Familie unabhängig vom MycN-Status zu sein scheint. Die hier vorgestellten Ergebnisse liefern wichtige Einblicke in die molekularen Mechanismen der RIST-Therapie und bilden die Grundlage für weitere Folgestudien zur dringend notwendigen Verbesserung der Therapie für Patienten mit refraktärem bzw. rezidiviertem Neuroblastom.