Background: In-vitro chondrogenically differentiated, mesenchymal stem cells (MSCs) bear a great chance for tissue engineering of cartilage defects, but tend to undergo hypertrophy during in vitro chondrogenesis, leading to calcification mirroring endochondral ossification in the growth plate when reimplanted. The Retinoic acid (RA) signaling pathway plays an essential role during limb ...
Abstract (English)
Background: In-vitro chondrogenically differentiated, mesenchymal stem cells (MSCs) bear a great chance for tissue engineering of cartilage defects, but tend to undergo hypertrophy during in vitro chondrogenesis, leading to calcification mirroring endochondral ossification in the growth plate when reimplanted. The Retinoic acid (RA) signaling pathway plays an essential role during limb development, favoring hypertrophic differentiation, whereas a RA receptor (RAR) inverse agonist, BMS493, was shown to attenuate hypertrophy. In order to further analyze the role of the physiological agonist RA and before employing the inverse agonist, human MSCs in 3D aggregate culture were treated with different RA doses and media change models under chondrogenic conditions.
Materials and methods: Bone marrow derived human MSCs were seeded into 96- well V-bottom plates at 2x105 cells/ well and centrifuged to form pellets. The pellets were cultivated with standard chondrogenic differentiation media for 7 days, with addition of 1, 10 and 100 nM RA with every media change, thrice per week or as a single shot when pellets were formed. Cells were harvested at day 1, 4 and 7. Gene expressions of 3 receptors (RAR alpha, beta and Retinoid X receptor alpha) and 5 RA target genes (Rbp1, Crabp2, Hoxa1, A2M, Cyp26b1) were analyzed via real time qPCRs and on protein level via Western-Blots and Immunohistochemistry.
Results: RA has shown to have a dose-dependent significant influence on expression of its own target genes. We found most significant effects with 100 nM RA, whereas doses of 1 nM and mostly 10 nM had no significant effects. While treatment 3x/ week seemed to be equally to more effective as a daily RA addition, a single shot of RA has not been able to maintain upregulation of gene expression over several days. Conclusion: Regarding to our results RA downstream signaling seems to be dose dependent. Understanding the regulation of RA signaling better, may help to find the right dose and sides of action of antagonists to generate stable hyaline cartilage for tissue engineering (TE).
Translation of the abstract (German)
Hintergrund: In-vitro chondrogen differenzierte, mesenchymale Stammzellen (MSCs) bieten ein vielversprechendes Potenzial zur Therapie von Knorpelschäden mittels Tissue Engineering, jedoch tendieren die Zellen zu Hypertrophieprozessen während der in-vitro Chondrogenese. Diese führen wiederum bei Reimplantation zu Kalzifizierung, analog zur enchondralen Ossifikation in der Wachstumsfuge. Der ...
Translation of the abstract (German)
Hintergrund: In-vitro chondrogen differenzierte, mesenchymale Stammzellen (MSCs) bieten ein vielversprechendes Potenzial zur Therapie von Knorpelschäden mittels Tissue Engineering, jedoch tendieren die Zellen zu Hypertrophieprozessen während der in-vitro Chondrogenese. Diese führen wiederum bei Reimplantation zu Kalzifizierung, analog zur enchondralen Ossifikation in der Wachstumsfuge. Der Retinsäure (RA)-Signalweg spielt eine essenzielle Rolle während der Entwicklung der Gliedmaße, wobei eine hypertrophe Differenzierung begünstigt wird. Der inverse RA-Rezeptor (RAR) Agonist BMS493 dagegen zeigte eine Hemmung dieses Hypertrophieverhaltens. Um die Rolle des physiologischen Agonisten RA genauer zu untersuchen, wurden humane MSCs in der 3D-Aggregat-Kultur mit unterschiedlichen RA-Konzentration und Mediumwechselmodellen unter chondrogenen Bedingungen behandelt.
Material und Methoden: Humane, mesenchymale Knochenmarks-Stammzellen wurden mit 2x105 Zellen/well in 96-well-Platten übertragen und zentrifugiert um Pellets zu formen. Die Pellets wurden mit chondrogenem Differenzierungsmedium für 7 Tagen kultiviert, wobei bei jedem Mediumwechsel Konzentrationen von 1, 10 und 100 nM RA 3x/ Woche, täglich oder als Single-Shot hinzugegeben wurden. Die Zellen wurden an Tag 1, 4 und 7 entnommen. Es wurde die Genexpression von 3 Rezeptoren (RAR alpha, beta und Retinoid X Rezeptor alpha), sowie 5 Zielgenen von RA (Rbp1, Crapb2, Hoxa1, A2M, Cyp26b1) via Echtzeit-qPCRs analysiert, als auch auf Proteinebene mittels Western-Blots und Immunhistochemie.
Ergebnisse: Retinsäure zeigte einen dosisabhängigen Einfluss auf seine Zielgene. Wir fanden die am stärksten signifikanten Effekte mit 100 nM RA, während 1 nM und 10 nM meistens keine signifikanten Effekte zeigten. Während die Gabe 3x/ Woche gleich oder sogar effektiver als die tägliche Gabe schien, konnte die einmalige Gabe keine Hochregulierung der Genexpression über mehrere Tage aufrecht erhalten.
Schlussfolgerung: Bezogen auf unsere Ergebnisse scheint die Downstream-Aktivität des RA-Signalwegs dosisabhängig zu sein. Das bessere Verständnis des RA-Signalwegs könnte helfen die richtige Dosis und Wirkorte von Antagonisten zu finden, um stabilen, hyalinen Knorpel für Tissue Engineering herstellen zu können.
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