Archaeal transcription is carried out by a multi-subunit RNA polymerase (RNAP) that is highly homologous in structure and function to eukaryotic RNAP II. Among the set of basal transcription factors, only Spt5 is found in all domains of life, but Spt5 has been shaped during evolution, which is also reflected in the heterodimerization of Spt5 with Spt4 in Archaea and Eukaryotes. To unravel the mechanistic basis of Spt4/5 function in Archaea, we performed structure-function analyses using the archaeal transcriptional machinery of Pyrococcus furiosus (Pfu). We report single-particle cryo-electron microscopy reconstructions of apo RNAP and the archaeal elongation complex (EC) in the absence and presence of Spt4/5. Surprisingly, Pfu Spt4/5 also binds the RNAP in the absence of nucleic acids in a distinct super-contracted conformation. We show that the RNAP clamp/stalk module exhibits conformational flexibility in the apo state of RNAP and that the enzyme contracts upon EC formation or Spt4/5 engagement. We furthermore identified a contact of the Spt5-NGN domain with the DNA duplex that stabilizes the upstream boundary of the transcription bubble and impacts Spt4/5 activity in vitro.

Die Transkription in Archaea wird durch eine aus mehreren Untereinheiten bestehende RNA-Polymerase (RNAP) durchgeführt, die in Struktur und Funktion eine hohe Homologie zur eukaryotischen RNAP II aufweist. Von den basalen Transkriptionsfaktoren kommt nur Spt5 in allen Domänen des Lebens vor, aber Spt5 hat sich im Laufe der Evolution verändert, was sich auch in der Heterodimerisierung von Spt5 mit Spt4 in Archaea und Eukaryoten widerspiegelt. Um die mechanistischen Grundlagen der Spt4/5-Funktion in Archaea aufzuklären, haben wir Struktur-Funktions-Analysen unter Verwendung des archaealen Transkriptionsapparats von Pyrococcus furiosus (Pfu) durchgeführt. Wir berichten über Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie-Rekonstruktionen von Apo-RNAP und dem archaealen Elongationskomplex (EC) in Abwesenheit und Anwesenheit von Spt4/5. Überraschenderweise bindet Pfu Spt4/5 auch in Abwesenheit von Nukleinsäuren an das RNAP in einer ausgeprägten superkontrahierten Konformation. Wir zeigen, dass das RNAP-Clamp/Stalk-Modul im Apo-Zustand von RNAP konformationelle Flexibilität aufweist und dass sich das Enzym bei der EC-Bildung oder der Bindung von Spt4/5 zusammenzieht. Darüber hinaus haben wir einen Kontakt der Spt5-NGN-Domäne mit dem DNA-Doppelstrang identifiziert, der die stromaufwärtige Grenze der Transkriptionsblase stabilisiert und die Spt4/5-Aktivität in vitro beeinflusst.