Microproteins represent a class of short polypeptides with very diverse cellular functions. These small proteins frequently escape proteomic-based identifications, making their extent and theeir potential functions largely elusive. Many microproteins originate from transcripts that are annotated as non-coding such as long non-coding RNAs (lncRNAs), circular RNAs (circRNAs) and micro RNAs (miRNAs). However, also messenger RNAs (mRNAs) can contain additional short open reading frames (sORFs) that encode microproteins.
In this work, we functionally characterize SMIM26, a microprotein localized to mitochondria. In biochemical and single molecule tracking studies, we find that SMIM26 interacts with VDAC1/2 in the outer mitochondrial membrane and SLC25A6 in the inner mitochondrial membrane. We show that it spans the intermembrane space where it interacts with PGAM5 and is phosphorylated at distinct residues. Knockout cancer cell lines are viable but have strongly reduced respiratory chain activity and are sensible to glucose starvation. Interestingly, knockout mice are not viable and die already at early developmental stages. Zebrafish homozygous smim26 mutants are viable, but show reduced fitness and survival compared to their wild-type or heterozygous siblings. Surprisingly, loss of smim26 induces female-to-male sex reversal in mutant fish. Consistent with the mitochondrial phenotype in cell lines, respiration is reduced in homozygous zebrafish embryos and components of the N- and Q-module in respiratory chain complex I are downregulated.
In cancer, loss of SMIM26 leads to dysregulated signaling pathways and high expression levels of SMIM26 alone or in combination with its binding partners is associated with worse survival in liver cancer. Based on the functional characterization and patient data, in a pilot anti-cancer drug screen we identify two compounds that display a stronger effect SMIM26 on knockout cell lines compared to wild-type.
Our work suggests that SMIM26 coordinates metabolite transport through the inner and outer mitochondrial membranes and is essential for respiratory function in vivo. Therefore, SMIM26 could be an interesting target for anti-cancer therapies in the future.

Mikroproteine stellen eine Klasse kurzer Polypeptide mit sehr vielfältigen zellulären Funktionen dar. Diese kleinen Proteine entgehen häufig proteomischen Identifizierungen, wodurch ihr Umfang und ihre potenziellen Funktionen weitgehend unklar bleiben. Viele Mikroproteine stammen aus Transkripten, die als nicht-kodierend annotiert sind, wie beispielsweise lange nicht-kodierende RNAs (lncRNAs), zirkuläre RNAs (circRNAs) und Mikro-RNAs (miRNAs). Allerdings können auch Messenger-RNAs (mRNAs) zusätzliche kurze offene Leserahmen (sORFs) enthalten, die für Mikroproteine kodieren.
In dieser Arbeit charakterisieren wir SMIM26, ein in den Mitochondrien lokalisiertes Mikroprotein, funktionell. In biochemischen Studien und Einzelmolekül-Tracking-Untersuchungen stellen wir fest, dass SMIM26 mit VDAC1/2 in der äußeren Mitochondrienmembran und mit SLC25A6 in der inneren Mitochondrienmembran interagiert. Wir zeigen, dass es den Intermembranraum überspannt, wo es mit PGAM5 interagiert und an bestimmten Aminosäuren phosphoryliert wird. Knockout-Krebszelllinien sind lebensfähig, weisen jedoch eine stark reduzierte Aktivität der Atmungskette auf und reagieren empfindlich auf Glukosemangel. Interessanterweise sind Knockout-Mäuse nicht lebensfähig und sterben bereits in frühen Entwicklungsstadien. Homozygote smim26-Mutanten sind lebensfähig in Zebrafischen, weisen jedoch im Vergleich zu ihren Wildtyp- oder heterozygoten Geschwistern eine verminderte Fitness und Überlebensfähigkeit auf. Überraschenderweise induziert der Verlust von smim26 bei mutierten Fischen eine Geschlechtsumkehr von weiblich zu männlich. In Übereinstimmung mit dem mitochondrialen Phänotyp in Zelllinien ist die Atmung in homozygoten Zebrafischlarven vermindert, und Komponenten des N- und Q-Moduls im Komplex I der Atmungskette sind herunterreguliert.
Bei Krebserkrankungen führt der Verlust von SMIM26 zu einer Dysregulation von Signalwegen, und eine hohe Expression von SMIM26 allein oder in Kombination mit seinen Bindungspartnern ist mit einer schlechteren Überlebensrate bei Leberkrebs assoziiert. Basierend auf der funktionellen Charakterisierung und Patientendaten identifizieren wir in einem Pilot-Screening für Krebsmedikamente zwei Chemotherapeutika, die in SMIM26-Knockout-Zelllinien eine stärkere Wirkung zeigen als in Wildtyp-Zelllinien.
Unsere Arbeit legt nahe, dass SMIM26 den Metaboliten-Transport durch die innere und äußere Mitochondrienmembran koordiniert und für die Atmungsfunktion in vivo essenziell ist. Daher könnte SMIM26 ein interessantes Ziel für zukünftige Krebstherapien sein.