CAR T cell therapy has demonstrated curative potential in advanced B-cell malignancies; however, its efficacy is limited by insufficient in vivo expansion, persistence, and functional heterogeneity. Although numerous retrospective studies have correlated clinical response rates with the presence of early memory T cells, particularly memory stem T cells (TSCM), the frequency of these cells remains underrepresented in current approved CAR T products and their therapeutic relevance has not yet been prospectively evaluated.
The primary aim of this thesis was to link CAR TSCM behavior to clinical response through in-depth longitudinal immunomonitoring of 11 patients treated with donor-derived CD8⁺ CAR TSCM cells, benchmarked against a cohort of 20 patients receiving conventional donor-derived CAR T cells. Mechanistic analyses showed that the higher complete remission rates at low doses and the improved safety profile of the TSCM-treated cohort were associated with enhanced CAR TSCM cell polyfunctionality, greater expansion, ability to generate both effector and self-renewing compartments through clonal succession, and a distinct cytokine profile characterized by IFNγ as the dominant inflammatory mediator versus IL-6 in the standard cohort. Importantly, treatment failure in the TSCM cohort was primarily driven by tumor- and host-mediated resistance mechanisms rather than intrinsic product defects.
The secondary aim of the study was to investigate the biological mechanisms underlying the absence of graft-versus-host disease (GvHD) in both cohorts following donor-derived CAR T cell therapy. A cell-based platform was developed to expand rare, naturally occurring alloreactive T cells from the original alloHSCT donor and engineer them with a CD28-based CAR. We demonstrate that, while CAR stimulation alone was sufficient to induce severe alloreactive CAR T cell dysfunction, concomitant TCR engagement amplified activation, leading to rapid exhaustion and apoptosis. Modulation of CD28-mediated signaling (via AKT inhibition or a milder costimulatory domain such as 41BB) restored alloreactive CAR T cell functionality and persistence. Consistently, phenotypic and transcriptomic profiling along with longitudinal TCR tracking of post-infusion patient samples showed that dominant alloreactive CAR T clones displayed a dysfunctional signature at the peak of expansion, with only transient proliferation and limited persistence overtime.
Collectively, by integrating longitudinal clinical immunomonitoring with mechanistic experimental modeling, this thesis demonstrates that TSCM enrichment in the infusion product improves CAR T cell efficacy and safety, and that CD28-based CAR signaling architecture constrains alloreactivity, ultimately limiting GvHD.

Die CAR-T-Zelltherapie hat bei fortgeschrittenen B-Zell-Malignomen ein kuratives Potenzial gezeigt; ihre Wirksamkeit wird jedoch durch eine unzureichende In-vivo-Expansion, Persistenz und funktionelle Heterogenität begrenzt. Obwohl zahlreiche retrospektive Studien klinische Ansprechraten mit dem Vorhandensein früher Gedächtnis-T-Zellen, insbesondere von T-Gedächtnisstammzellen (TSCM), in Zusammenhang gebracht haben, ist die Häufigkeit dieser Zellen in derzeit zugelassenen CAR-T-Produkten weiterhin unterrepräsentiert, und ihre therapeutische Relevanz wurde bislang nicht prospektiv untersucht.

Das primäre Ziel dieser Dissertation bestand darin, das Verhalten von CAR-TSCM-Zellen mit dem klinischen Ansprechen zu verknüpfen, und zwar durch ein umfassendes longitudinales Immunmonitoring von 11 Patienten, die mit Spender-abgeleiteten CD8⁺-CAR-TSCM-Zellen behandelt wurden, im Vergleich zu einer Kohorte von 20 Patienten, die konventionelle Spender-abgeleitete CAR-T-Zellen erhielten. Mechanistische Analysen zeigten, dass die höheren Komplettremissionsraten bei niedrigen Dosen sowie das verbesserte Sicherheitsprofil der mit TSCM behandelten Kohorte mit einer gesteigerten Polyfunktionalität der CAR-TSCM-Zellen, einer stärkeren Expansion, der Fähigkeit zur Bildung sowohl von Effektor- als auch selbsterneuernden Zellkompartimenten durch klonale Sukzession sowie mit einem charakteristischen Zytokinprofil assoziiert waren, das durch IFNγ als dominierenden inflammatorischen Mediator im Gegensatz zu IL-6 in der Standardkohorte geprägt war. Wichtig ist, dass das Therapieversagen in der TSCM-Kohorte hauptsächlich durch tumor- und wirtsvermittelte Resistenzmechanismen und nicht durch intrinsische Defekte des Produkts verursacht wurde.

Das sekundäre Ziel der Studie bestand darin, die biologischen Mechanismen zu untersuchen, die dem Ausbleiben einer Graft-versus-Host-Erkrankung (GvHD) in beiden Kohorten nach Spender-abgeleiteter CAR-T-Zelltherapie zugrunde liegen. Hierzu wurde eine zellbasierte Plattform entwickelt, um seltene, natürlicherweise vorkommende alloreaktive T-Zellen aus dem ursprünglichen alloHSCT-Spender zu expandieren und mit einem CD28-basierten CAR zu modifizieren. Wir zeigen, dass bereits die alleinige CAR-Stimulation ausreichte, um eine schwere Dysfunktion alloreaktiver CAR-T-Zellen zu induzieren, während eine gleichzeitige TCR-Aktivierung die Zellaktivierung verstärkte und zu rascher Erschöpfung sowie Apoptose führte. Die Modulation der CD28-vermittelten Signalübertragung (durch AKT-Inhibition oder durch die Verwendung einer milderen kostimulatorischen Domäne wie 41BB) stellte die Funktionalität und Persistenz alloreaktiver CAR-T-Zellen wieder her. Übereinstimmend damit zeigten phänotypische und transkriptomische Profilierungen sowie longitudinales TCR-Tracking von Patientenproben nach Infusion, dass dominante alloreaktive CAR-T-Klone auf dem Höhepunkt ihrer Expansion eine dysfunktionale Signatur aufwiesen, begleitet von lediglich vorübergehender Proliferation und begrenzter Persistenz im Zeitverlauf.

Zusammenfassend zeigt diese Dissertation durch die Integration longitudinalen klinischen Immunmonitorings mit mechanistischer experimenteller Modellierung, dass eine Anreicherung von TSCM-Zellen im Infusionsprodukt die Wirksamkeit und Sicherheit der CAR-T-Zelltherapie verbessert und dass die CD28-basierte Signalar­chitektur von CARs die Alloreaktivität einschränkt und dadurch letztlich GvHD begrenzt.