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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-2783
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.10118
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 7 August 2003 |
| Referee: | PD Dr. Michael Rehli and Prof. Dr. Armin Buschauer |
| Date of exam: | 15 July 2003 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Innere Medizin III (Hämatologie und Internistische Onkologie) Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical/Medicinal Chemistry II (Prof. Buschauer) |
| Keywords: | Toll-like Rezeptoren , Genregulation , Phagozyt , Mustererkennung , , toll-like receptor , transcriptional regulation , innate immunsystem |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 10118 |
Abstract (German)
Toll-like Rezeptoren (TLR) sind Transmembranproteine, die sowohl für die angeborene als auch für die erworbene Immunantwort eine wichtige Rolle spielen. Diese Dissertation beschäftigt sich mit der Regulation von drei TLR-Genen in mononukleären Phagozyten des Menschen und der Maus. Es wurden hauptsächlich die genomischen Strukturen und regulatorischen Bereiche, die sogenannten proximalen ...
Abstract (German)
Toll-like Rezeptoren (TLR) sind Transmembranproteine, die sowohl für die angeborene als auch für die erworbene Immunantwort eine wichtige Rolle spielen. Diese Dissertation beschäftigt sich mit der Regulation von drei TLR-Genen in mononukleären Phagozyten des Menschen und der Maus. Es wurden hauptsächlich die genomischen Strukturen und regulatorischen Bereiche, die sogenannten proximalen Promotoren definiert und regulierende Faktoren identifiziert, die sowohl bei der Regulation der basalen als auch der induzierten Expression des TLR2, TLR3 und TLR4 eine wichtige Rolle spielen.
Zur Charakterisierung der regulatorischen Sequenz des humanen TLR2-Gens wurden Transkriptionsstartpunkte definiert und mittels Datenbankanalysen die Genstruktur ermittelt. Anhand von Monozyten mRNA wurden alternative Spleißvorgänge in Exon II detektiert, welche zu unterschiedlichen Isoformen der TLR2-mRNA führen. Der 5`-regulatorische Bereich des humanen TLR2-Gens wurde festgelegt und in Reporteranalysen weiter charakterisiert. Der proximale Promotor umfasst einen Bereich von 220 bp vor dem Transkriptionsstart. Da der humane TLR2-Promotor in einer CpG-Insel liegt, wurden Methylierungsuntersuchungen durchgeführt. Eine gewebespezifische Methylierung des Promotors war jedoch nicht festzustellen. Anhand von Mutationsanalysen, Gelshiftassays und Kotransfektionen konnte eine wichtige Rolle der Transkriptionsfaktoren Sp1 und PU.1 für die Expression von TLR2 in mononukleären Phagozyten nachgewiesen werden. Eine LPS-Aktivierung von humanen Monozyten führte, anders als in Makrophagen der Maus, zu keiner Induktion von TLR2-mRNA. Eine Hochregulation der humanen TLR2-mRNA nach 3 h war auf die Adhärenz der Zellen an die Plastikschale zurückzuführen und nicht auf eine Stimulation mit LPS.
Die Regulation von TLR3 wurde in mononukleären Phagozyten aus Mensch und Maus untersucht. Anhand semiquantitativer PCR wurde in einem direkten Vergleich der TLR3-Expression beider Spezies eine zelltypspezifische Expression festgestellt. TLR3-mRNA des Menschen kommt spezifisch auf dendritischen Zellen vor, TLR3-mRNA der Maus wird hauptsächlich auf Makrophagen exprimiert. Induktionsanalysen ergaben, dass TLR3-mRNA in beiden Spezies durch IFN-b induziert wird. Die Genstrukturen von humanen und murinen TLR3 wurden ermittelt und anhand von Transfektionsanalysen wurden die regulatorischen Bereiche des TLR3-Gens beider Spezies definiert und charakterisiert. Die Struktur der TLR3-Promotoren hinsichtlich Architektur und möglicher Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren ist in beiden Spezies unterschiedlich, es befinden sich jedoch sowohl in humanen als auch in murinen TLR3-Promotor IFN-regulierte Elemente. Mutationsstudien, Gelshifts und Kotransfektionen ergaben, dass IRF1 und IRF2 die Expression des TLR3-Gens in Mensch und Maus regulieren. Anhand von Knockout-Mäusen konnte geklärt werden, dass die Induktion von TLR3-mRNA in der Maus über den Jak-STAT-IRF-Signalweg verläuft. Die Hochregulation von TLR3-mRNA der Maus durch LPS wird über autokrines IFN-b vermittelt. Im Menschen wird TLR3-mRNA durch LPS nicht induziert und in mit LPS vorstimulierten DC blieb eine durch IFN-b induzierte Hochregulation von TLR3-mRNA aus. Es bleibt noch zu klären, welche Faktoren durch LPS induziert werden, die eine negative Regulation von humanen TLR3-mRNA erklären.
Die Genstrukturen und 5`-Bereiche des TLR4-Gens in Mensch und Maus waren von unserer Arbeitsgruppe bereits identifiziert und mittels Reporteranalysen wurden der humane und murine proximale TLR4-Promotor weiter charakterisiert und miteinander verglichen. Den Transkriptionsfaktoren PU.1 und ICSBP konnte anhand von Mutationsassays und Gelshifts eine wichtige Rolle bei der Regulation des TLR4-Gens sowohl in Mensch als auch in Maus nachgewiesen werden. Der humane TLR4-Promotor war in Transfektionen trotz eines hohen Konservierungsgrades wesentlich aktiver ist als der murine TLR4-Promotor. Um die regulatorischen Bereiche zu charakterisieren, die für die unterschiedliche Aktivität verantwortlich sind, wurden Reporteranalysen mit chimären Konstrukten aus humanen und murinen TLR4-Promotor durchgeführt. Die stärkere Aktivität des humanen TLR4-Promotors wurde vor allem durch Bereiche unterhalb der konservierten PU.1/ICSBP-Site vermittelt, die den humanen Transkriptionsstart enthalten. Das humane und murine TLR4-Gen besitzen durch die unterschiedliche Lage der Transkriptionsstartpunkte eine unterschiedliche Promotorarchitektur. In nachfolgenden Untersuchungen sollen die regulatorischen Sequenzen des TLR4-Gens in Mensch und Maus weiter charakterisiert werden.
Translation of the abstract (English)
Toll-like receptors are transmembrane receptors, playing an important role for the immunsystem. In this work we investigated the transcriptional regulation of the Toll-like receptors TLR2, TLR3 and TLR4 in mononuclear cells. We defined the genomic structures and the regulatory sequences of these pattern recognition receptors and identified transcription factors, important for the basic and ...
Translation of the abstract (English)
Toll-like receptors are transmembrane receptors, playing an important role for the immunsystem. In this work we investigated the transcriptional regulation of the Toll-like receptors TLR2, TLR3 and TLR4 in mononuclear cells. We defined the genomic structures and the regulatory sequences of these pattern recognition receptors and identified transcription factors, important for the basic and regulated expression.
To characterize the regulatory sequence of human TLR2-gene, we determined the proximal promoter, the full 5'-sequence and transcriptional start sites of TLR2 mRNA. The human TLR2 gene was found to consist of two 5'- non-coding exons followed by a third coding exon. Alternative splicing of exon II was detected primarily in human blood monocytes. The proximal promoter, exon I and part of intron I were found to be located in a CpG island. Although CpG- methylation of the proximal human TLR2 promoter in cell lines correlated with TLR2 repression, the promoter was un-methylated in primary cells indicating that CpG-methylation does not contribute to the cell-type specific expression of human TLR2 in normal tissues. The promoter sequence contains putative binding sites for several transcription factors including Sp1-, and Ets- family members. Reporter gene analysis revealed a minimal promoter of 220 bp which was found to be regulated by Sp1, Sp3 and possibly PU.1. Interestingly, no sequence homology was detected between human and murine TLR2 promoter regions. In contrast to murine TLR2, expression of human TLR2 in monocytes/macrophages is not induced by the pro-inflammatory stimuli LPS or MALP-2 and reporter activity of the promoter was not enhanced by stimuli-induced NF-kB activation in THP-1 or Mono-Mac6 cells.
Toll-like receptor 3 (TLR3) recognizes double-stranded (ds)RNA, a molecular pattern associated with viral infections. Earlier studies suggested a differential expression pattern in men and mice, the molecular basis for this observation, however, was unknown. Here we demonstrate that species-specific differences in tissue expression and responses to lipopolysaccaride (LPS) coincide with the presence of different, evolutionary non-conserved promoter sequences in both species. Despite the overall unrelatedness of TLR3 promoter sequences, mRNA expression of both TLR3 orthologues was induced by interferons, particularly by IFN-b. The basal and IFN-b-induced activation of promoters from both species largely depended on similar interferon regulatory factor (IRF) elements which constitutively bound IRF-2 and recruited IRF-1 after stimulation. In murine macrophages, IFN-b-induced TLR3 up-regulation required IFNAR1, STAT1, and in part IRF-1, but not the Janus kinase (Jak) family member Tyk2. We also show that LPS specifically upregulates TLR3 expression in murine cells through the induction of autocrine/paracrine IFN-b. In humans, however, IFN-b induced upregulation of TLR3 was blocked by pretreatment with LPS, despite the efficient induction of IRF-1. Our findings reveal a mechanistic basis for the observed differences as well as similarities in TLR3 expression in men and mice.
Since a differential regulation of the major LPS sensor Toll-like receptor (TLR4) may contribute to the varying LPS sensitivity in both species, we initiated a detailed comparison of TLR4 promoters in both species. Transient transfection analysis using chimerical or mutated reporter constructs revealed differential requirements for individual conserved PU.1 sites as well as a novel GC-rich element downstream of the conserved composite IRF/Ets- element that was absolutely required for reporter activity of the human but not the murine TLR4 promoter. Determination of transcription start sites in endogenous TLR4 genes of primary human and murine macrophages showed that the human start site was located within an initiator-like sequence downstream of the novel GC-element. In contrast, the murine start site was found approximately 200 bp upstream of the conserved IRF/Ets-element. Transcripts initiated from the human TLR4 reporter construct utilized the correct human start site irrespective of the species origin of the transiently transfected cell, suggesting that the human start site was determined by the promoter sequence rather than species specific transcription factors. The corresponding murine Tlr4 reporter construct however initiated luciferase transcripts from a location 20 bp downstream of the endogenous murine transcription start site in murine RAW264.7 cells indicating that additional up- or downstream elements are required for the correct assembly of the transcription initiation complex at the murine promoter. In conclusion our data suggest that the initiation of TLR4 transcription in human and murine macrophages is determined by species-specific sequences resulting in different promoter architectures and activities.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 13:41
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