Herpesvirus saimiri basierte Vektoren für die somatische Gentherapie der Rheumatoiden Arthritis

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Wieser, Carsten

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Date of publication of this fulltext: 15 Jul 2004 15:35

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Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Date:	14 July 2004
Referee:	Prof. Dr. Armin Buschauer
Date of exam:	9 June 2004
Institutions:	Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical/Medicinal Chemistry II (Prof. Buschauer)
Keywords:	Herpesvirus saimiri , Vektor <Genetik> , Gentherapie , rheumatoide Arthritis , , Herpesvirus saimiri , viral vector , gene therapy , rheumatoid arthritis
Dewey Decimal Classification:	500 Science > 540 Chemistry & allied sciences
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	10209

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Abstract (German)

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Auf Herpesvirus saimiri basierende Vektoren für die Gentherapie können eine Alternative zu etablierten Vektoren darstellen, insbesondere aufgrund ihrer hohen Klonierungskapazität, der Infizierbarkeit verschiedenster Zelltypen und ihrer Fähigkeit zur episomalen Persistenz. Viele Erkrankungen erfordern eine steuerbare Expression eingebrachter Gene, wobei sich der Einsatz regulierbarer eukaryonter Expressionssysteme als hilfreich erwies. Um dies auch mit HVS-Vektoren zu ermöglichen, wurde zunächst das regulatorische GeneSwitch�-System zusammen mit anti-inflammatorischen Interleukinen in das virale Genom integriert. Attenuierte Vektoren wurden mittels homologer Rekombination hergestellt, verifiziert in Bezug auf korrekte Insertion und Rekombination, und die Selektivität und Sensitivität des induzierbaren Systems im viralen Kontext untersucht. Es zeigte sich, daß eine unselektive Aktivierung des GeneSwitch�-Systems durch dessen ursprünglichen Liganden Progesteron bei physiologischen Werten nicht beobachtet werden kann, und unerwünschte Interaktionen in vivo nicht zu erwarten sind. Eine Aktivierung des induzierbaren Systems gelang mit einer um mehr als 1000-fach geringeren Mifepristondosis als für Progesteron-antagonistische Effekte erforderlich wäre. Bei Expressionsuntersuchungen in humanen Fibroblasten war eine von der Vektordosis abhängige Transgenproduktion beobachtbar, welche nach einigen Tagen ihr Maximum erreichte und danach kontinuierlich absank. In primären Synoviozyten zeigte sich eine langanhaltende Interleukinexpression, sowie ein deutlicher Einfluß zellulärer Parameter. Eine mehrfache Aktivierung des Expressionssystems war in beiden Zelltypen nicht möglich. Untersuchungen zum Transaktivatorprotein auf RNA- und Proteinebene korrelierten mit diesen Daten, und zeigten eine im Zeitverlauf abnehmende Bildung bzw. ausbleibende sekundäre Aktivierung. Mögliche Ursachen wie ein Verlust der episomalen Vektorkopien, eine Methylierung des für die Expression des Transaktivators verantwortlichen Promotors, oder der spezifischen Transaktivatorprotein-Bindestellen wurden untersucht. Es fand sich eine gewisse Reduktion der Vektorkopien im Zeitverlauf, während DNA-Methylierungsprozesse als Ursache ausgeschlossen werden konnten. Denkbar erscheint auch eine verringerte Expression der eingeführten Fremdgene durch allgemeine zelluläre Regulationsmechanismen, oder eine Kombination aller dargestellten Effekte mit additiver oder potenzierender Wirkung. Die biologische Funktion der exprimierten Interleukine wurde anhand der Blockade der IL-1 aktivierten MMP-3 Expression in RASF Zellen veranschaulicht. Die Daten bilden eine Basis für erste präklinische Studien im SCID-Mausmodell der rheumatoiden Arthritis.

Translation of the abstract (English)

Herpesvirus saimiri based vectors represent an alternative to established vector types because of the high cloning capacity, the ability to infect various cell types and the episomal persistence of the vector. Gene therapy of disease often requires the possibility of regulated transgene expression; eukaryotic regulatory expression systems are a helpful tool in this context. In order to allow inducible transgene expression in HVS vectors, we integrated the regulatory GeneSwitch� system into the viral genome in combination with anti-inflammatory cytokines. Construction of attenuated vectors was performed by homologous recombination using a cosmid system. After correct homologous recombination events and transgene insertion were verified, the selectivity and sensitivity behaviour of the inducible system were analyzed in the viral context. Thereby unselective activation of the GeneSwitch� system by the original ligand Progesterone could not be observed within the physiologic dose range of Progesterone. Mifepristone doses more than 1000-fold lower than required for Progesterone antagonistic effects were sufficient to activate the inducible system. Expression analysis in human fibroblasts (HFF) showed that transgene production depended on the vector dose, and had a maximum several days after transduction. Long-term transgene expression and a distinct influence of cellular parameters could be observed in human synoviocytes (RASF). However, in both HFF and RASF cell types multiple consecutive activation of the expression system was not successful. Analysis of the transactivator protein at the RNA and protein level correlated to this data since it showed a decreasing protein amount and a absent secondary activation. Possible causes were analyzed, like the loss of viral episomes, methylation of the transactivator promoter or methylation of DNA-specific transactivator binding domains. A reduction of episomal vector copies could be detected over the time while an involvement of DNA-methylation processes could be excluded. A reduction of introduced genes by general cellular regulatory mechanisms or a combination of factors with additive or potentiated force might be an explanation of the absent secondary induced expression. The biologic function of the expressed interleukins could be demonstrated blocking the IL-1 stimulated MMP-3 expression in RASF cells. These data represent the basis for first preclinical trials in the SCID-mouse model of rheumatoid arthritis.

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