Untersuchungen zur pharmakologischen Beeinflussung der Toll-like Rezeptoren in der Sepsis

URN to cite this document:: urn:nbn:de:bvb:355-opus-5773
DOI to cite this document:: 10.5283/epub.10355

Brandl, Katharina

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Date of publication of this fulltext: 21 Oct 2005 07:03

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In der bakteriellen Sepsis gerät das angeborene Immunsystem durch Überflutung mit mikrobiellen Produkten außer Kontrolle. Diese immunbedingte Überaktivierung führt zum Organversagen mit häufig letalem Ausgang. Für die Auslösung einer Immunantwort gegen Gram-negative und Gram-positive Bakterien sind TLR4 und TLR2 verantwortlich. In der vorliegenden Arbeit wurde zum einen die Hypothese geprüft, ob eine Kontrolle der Gram-negativen oder Gram-positiven induzierten Signaltransduktion durch Ligand-bindende lösliche Rezeptoren diese Überaktivierung verhindert. Da zur Signaltransduktion durch TLRs mindestens eine Dimerisierung nötig ist, wurden die rekombinanten Fusionsproteine FlagmrsTLR2-IgGFc (T2Fc) und FlagmrsTLR4-IgGFc (T4Fc), bestehend aus dem extrazellulären Teil von TLR2 bzw. 4 und humanem IgG-Fc, der Maus hergestellt. Zur Messung der biologischen Aktivität der Proteine wurden Zellen der murinen Makrophagen Zelllinie RAW 264.7 mit den jeweiligen TLR Aktivatoren stimuliert und anschließend das Zytokin IL-6 im Überstand per ELISA gemessen. Auf Zusatz von T2Fc ergab sich ein positiv synergistischer Effekt auf die Pam3Cys oder LTA induzierte IL-6 Sekretion in RAW 264.7. Hingegen wurde auf Zusatz von LPS als TLR4 Stimulus die Ausschüttung von IL-6 mit dem Fusionsprotein T4Fc nicht verändert. Essentiell für den erwünschten �Hemmeffekt� von löslichem TLR4 (der Erniedrigung der Synthese proinflammatorischer Zytokine) wäre die Ausbildung des T4Fc/MD-2 Komplexes, der für die LPS Signaltransduktion entscheidend ist. Da dieser im Überstand von RAW 264.7 nicht nachgewiesen werden konnte, wurde des Weiteren rekombinantes Flag-markiertes MD-2 produziert. Koimmunpräzipitations-experimente zeigten, dass MD-2 und T4Fc einen Komplex bildeten, der mit biotinyliertem LPS interagierte, T4Fc hingegen alleine band kein LPS. Der T4Fc/MD-2 Komplex führte auch zu einer Dosis-abhängigen Hemmung der IL-6 Sekretion in LPS stimulierten RAW 264.7. In Analogie zu den so genannten Cytokine Traps wurde dann ein Fusionsprotein hergestellt, welches die beiden Komponenten des LPS-Rezeptor Komplexes, TLR4 und MD-2, in einem Molekül vereinte. Der extrazelluläre Teil von TLR4 wurde über einen flexiblen Linker an MD-2 fusioniert. C-terminal enthält die LPS-Trap ein HIS-Markerpeptid oder alternativ einen huIgGFc-Teil. Auch das Designermolekül LPS-Trap war in der Lage, LPS zu binden und führte zu einer Hemmung der LPS-Aktivität in vitro. Erste Daten zeigen auch eine erfolgreiche Hemmung in vivo. Der Komplex aus T4Fc/MD-2 und auch die LPS-Trap haben somit das Potential einer neuen Therapieoption für die Sepsis.
Ein weiterer Teil der Arbeit untersuchte die Expression von TLR2 und TLR4 auf Monozyten und Granulozyten septischer Patienten im Vergleich zu einem gesunden Kontrollkollektiv. Die TLR2 Expression auf Monozyten und Granulozyten septischer Patienten zeigte keinen signifikanten Unterschied im Vergleich mit der Kontrollgruppe. Hingegen war die TLR4 Expression auf den Monozyten septischer Patienten bereits vor Stimulation mit LPS signifikant erhöht. Diese ließ sich jedoch im Gegensatz zu den Zellen des Kontrollkollektives durch LPS nicht weiter steigern. Setzt man voraus, dass das Kollektiv der septischen Patienten im Rahmen der Bakteriämie einem in vivo LPS Stimulus ausgesetzt war, zeigen die Daten eine direkte Korrelation der TLR4 Expression auf Monozyten und LPS Stimulation in vivo und in vitro.
Ein dritter Themenkomplex der Dissertation beschäftigte sich mit der Herstellung monoklonaler und polyklonaler Antikörper gegen löslichen TLR2 bzw. TLR4 zur Etablierung eines ELISAs für lösliches TLR. Es konnte ein spezifisches Antiserum gegen murinen TLR4 gewonnen werden.

Translation of the abstract (English)

Toll-like receptor (TLR)-induced signaling is involved in infectious diseases, chronic inflammatory diseases and sepsis, therefore, TLR-signaling via ligand-binding soluble receptors was modulated. TLR2 and TLR4 recognize Gram-positive and Gram-negative cell wall structures, respectively. In this study the mouse recombinant fusion proteins mrsTLR2-IgGFc (T2Fc) and mrsTLR4-IgGFc (T4Fc) were prepared in Drosophila melanogaster Schneider 2 (S2) cells to modulate signaling via these membrane-bound TLRs. To determine the function of soluble TLRs, IL-6 concentrations were measured after stimulation of mouse macrophage cell line cells RAW 264.7 with the proper ligands. T2Fc had a positive synergistic effect on (S)-[2,3-Bis(palmitoyloxy)-(2-RS)-propyl]-N-palmitoyl-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys4-OH] (Pam3Cys)-induced IL-6 production, whereas T4Fc had no influence on IL-6 levels induced with purified lipopolysaccharide (LPS). Because MD-2 is required for efficient stimulation of membrane TLR4, tagged MD-2 was prepared to generate a T4Fc/MD-2 complex. This complex blocked LPS activity in vitro. In analogy to �cytokine traps�, a designer molecule (LPS-Trap) was prepared by fusing MD-2 to the C-terminus of soluble TLR4 via a flexible linker. The LPS-Trap significantly inhibited TNF production by LPS-stimulated RAW 264.7 cells. In addition, first in vivo data showed a protective effect of the LPS-Trap in LPS stimulated NMRI mice. Thus, the T4Fc/MD-2 complex as well as the LPS-Trap blocked LPS activity and might thus represent a new therapeutic option in sepsis by neutralization of TLR4-activating ligands.
Another part of the thesis aimed to assess possible alterations of the surface display of TLR2 and TLR4 on monocytes and granulocytes derived from patients with sepsis in comparison with healthy controls. There were no significant differences of TLR2 display on monocytes and granulocytes from septic patients compared to controls. However, surface display of TLR4 on monocytes from septic patients at baseline was significantly higher than in healthy controls but there was no further response to LPS, whereas controls showed a significant increase of TLR4 display on the cell surface after LPS stimulation. These data demonstrated an increase of TLR4 presence on monocytes upon bacterial challenge in the setting of sepsis and in vitro.
The third part of the thesis dealt with the production of monoclonal and polyclonal antibodies against soluble TLR2 and TLR4 to establish an ELISA for soluble TLRs. A polyclonal antibody against murine TLR4 could be produced.

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