| License: Publishing license for publications excluding print on demand (2MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-6257
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.10423
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 9 March 2006 |
| Referee: | Prof. Dr. Gerd Schmitz and Prof. Dr. Armin Buschauer |
| Date of exam: | March 2006 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical/Medicinal Chemistry II (Prof. Buschauer) |
| Keywords: | High-density-Lipoproteine , Apolipoprotein A , Monozyten-Makrophagen-System , Fibroblast , Elektronensprayionisations-Massenspektrometrie , Kaliumkanal , Inhibitor , Sphingolipide , Monozyten-Makrophagen-System , Lipidefflux , Sphingolipide , Kalium-Kanal-Inhibitoren , Lipid efflux , sphingolipids , K+-channel-inhibitors |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 10423 |
Abstract (German)
Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde das für Fibroblasten bereits etablierte System des spezifischen Lipideffluxes mit Apolipoprotein A-I (ApoA-I) auf von freiwilligen Spendern gewonnene Monozyten übertragen. Optimale Ergebnisse im spezifischen Lipidefflux wurden dabei nach einer viertägigen Differenzierung mit M-CSF, mit einer Zellzahl von 750.000 ausgesäten Monozyten sowie einer ...
Abstract (German)
Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde das für Fibroblasten bereits etablierte System des spezifischen Lipideffluxes mit Apolipoprotein A-I (ApoA-I) auf von freiwilligen Spendern gewonnene Monozyten übertragen. Optimale Ergebnisse im spezifischen Lipidefflux wurden dabei nach einer viertägigen Differenzierung mit M-CSF, mit einer Zellzahl von 750.000 ausgesäten Monozyten sowie einer Beladung mit 40 µg/ml an enzymatisch modifiziertem LDL (E-LDL) erreicht. Der spezifische Lipidefflux betrug zwischen drei und acht Prozent für Cholesterin sowie zwischen drei und sechs Prozent für Phospholipide und war abhängig von den individuellen Unterschieden der jeweiligen Spender sowohl von Monozyten als auch von Plasma/E-LDL.
Zur näheren Charakterisierung des Lipideffluxes wurden mit Hilfe einer massenspektrometrischen Quantifizierung von Lipiden für beide Modelle die Unterschiede in Zellen und Medien bezüglich der Lipidklassen sowie deren Speziesmuster aufgezeigt. In Schaumzellen, welche aufgrund der Beladung mit E-LDL zellulär einen bedeutend höheren Anteil an Cholesterinestern (CE) aufwiesen, zeigte sich ebenso wie in Fibroblasten eine durch ApoA-I induzierte und somit für ABCA1 spezifische Entladung von Phosphatidylcholin (PC), Sphingomyelin (SPM) sowie v. a. von freiem Cholesterin (FC). Auf der Ebene der PC-Spezies ergab sich dabei für beide Zellmodelle eine präferentielle Entladung von einfach ungesättigten PC-Spezies, insbesondere von PC 34:1. Ferner konnte mittels massenspektrometrischer Analytik unter Verwendung von 13C-Cholesterin während der Effluxphase mit HDL3 eine partielle Beladung der Zellen mit CE gezeigt werden. Ebenso wurden in Medien von Schaumzellen CE detektiert, deren Anteil sich in Medien sowohl mit ApoA-I als auch mit HDL3 steigern ließ. Dieser Efflux von CE war in Fibroblasten nicht zu beobachten und ist vermutlich auf eine Induktion von ApoE zurückzuführen.
Um den Einfluss von Sphingolipiden auf den spezifischen Lipidefflux zu klären, wurden sowohl Fibroblasten als auch Schaumzellen in der Effluxphase mit verschiedenen Sphingolipiden inkubiert. Während Ceramid bei Schaumzellen stimulierend auf den ApoA-I spezifischen Efflux wirkte, wurde bei Fibroblasten eine konzentrationsabhängige hemmende Wirkung beobachtet. Darüber hinaus zeigten sich für Sphingosin und Sphingosin-1-Phosphat in Fibroblasten etwas stärker inhibierende Effekte auf den spezifischen Lipidefflux als im Modell mit Monozyten/Makrophagen. Um ferner eine potentielle Wirkung der Sphingolipide über PKC näher zu charakterisieren, wurde die Expression der PKC-Isoformen sowie deren Modulation durch Sphingolipide untersucht. Dabei konnte lediglich durch Phorbolmyristylacetat eine Hemmung des Lipideffluxes mit einer parallelen Downregulation der PKC-Isoformen epsilon, delta und zeta beobachtet werden. Somit könnte man von einer den spezifischen Lipidefflux modulierenden Rolle der PKC ausgehen, welche v. a. durch die Proteinmenge von PKC bestimmt wird.
In Analogie zur Regulation des Sulfonylharnstoff-Rezeptors wurde ferner der Einfluss von Kalium-Kanal-Inhibitoren auf den spezifischen Lipidefflux untersucht. Bei der Inkubation der beiden Zellsysteme mit verschiedenen Kalium-Kanal-Inhibitoren zeigte sich nur für Glibenclamid ein einheitlich hemmender Effekt auf den spezifischen Lipidefflux. Darüber hinaus wurde ein deutlich ausgeprägter, hemmender Einfluss auf die zellulären CE-Konzentrationen während der Be- und Entladungsphase gefunden, welcher jedoch nicht mit dem Verhalten eines Inhibitors der Acetyl-CoA:Cholesterin-Acyltransferase (ACAT) vergleichbar war. Weiterhin wurde in Anlehnung an die Ergebnisse mit GIRK-Inhibitoren der Einfluss von Modulatoren purinerger Rezeptoren auf den spezifischen Lipidefflux untersucht. Die Modulatoren purinerger Rezeptoren zeigten hierbei nur schwache und im Vergleich der beiden Zelltypen stark unterschiedliche Wirkungen auf den spezifischen Lipidefflux. Der beobachtete hemmende Einfluss von Suramin sowie von Clopidogrel lässt auf unspezifische, nicht auf einer Hemmung purinerger Rezeptoren beruhende Effekte dieser Substanzen schließen, da auch Agonisten purinerger Rezeptoren teilweise inhibierende Effekte aufwiesen.
Translation of the abstract (English)
The aim of this thesis was to transfer the well established system of apoA-I specific lipid efflux from fibroblasts to monocytes/macrophages. Thereby, the best fit was performed by the differentiation of 750.000 monocytes for four days with M-CSF to macrophages and an incubation with 40 µg/ml enzymatically modified LDL (E-LDL) for 24 hours. The apoA-I specific efflux was between three and eigth ...
Translation of the abstract (English)
The aim of this thesis was to transfer the well established system of apoA-I specific lipid efflux from fibroblasts to monocytes/macrophages. Thereby, the best fit was performed by the differentiation of 750.000 monocytes for four days with M-CSF to macrophages and an incubation with 40 µg/ml enzymatically modified LDL (E-LDL) for 24 hours. The apoA-I specific efflux was between three and eigth percent for cholesterol and between three and six percent for phospholipids. It further depended on the individual differences of donors for monocytes and LDL.
For a further characterisation of lipid efflux, a quantification by mass spectrometry of lipids in cells and media was performed for both cell models, which revealed the differences in its lipid classes and species. In macrophages - which showed higher cellular levels of cholestery esters (CE) because of a lipid load with E-LDL - as well as in fibroblasts, a specific efflux of phosphatidylcholine (PC), sphingomyelin (SPM) and free cholesterol (FC) was determined. For PC, a preferential apoA-I specific efflux of mono-unsaturated PC-species was found, in particular for PC 34:1. Using an incubation with 13C-cholesterol, the partial loading with CE of cells during efflux phase induced by HDL3 was demonstrated. Further more, we could also detect CE in media effluxed from macrophage foam cells, which was elevated with apoA-I and HDL3. This efflux of CE was not found in media of fibroblasts and is probably induced by apoE.
To further elucidate the action of sphingolipids on apoA-I specific efflux, fibroblasts and macrophages were incubated with different sphingolipids during efflux phase. While ceramide stimulated apoA-I specific efflux in foam cells, it blocked the apoA-I specific efflux of fibroblasts. Further more, in fibroblasts stronger inhibiting effects were observed for sphingosine and sphingosine-1-phosphate compared to monocytes/macrophages. To further characterise the potential effects of sphingolipids on PKC, the expression of PKC-isoforms and its modulation by sphingolipids were analysed. Solely phorbol 12-myristate-13-acetate (PMA) displayed an inhibition of lipid efflux accompanied with a downregulation of PKC-isoforms epsilon, delta and zeta.
By incubation of both cell systems with different K+-channel-inhibitors, only glibenclamide revealed a consistently inhibiting effect on apoA-I specific lipid efflux. Thereby, a more prominent inhibiting effect of glibenclamide was detected on cellular CE-concentrations during both, load- and deloading phase, which was furter not equal to the effects of a commonly used inhibitor of acyl-CoA:cholesterol acyltransferase (ACAT). According to the results from GIRK-inhibitors, also the effects of different modulators on purinergic receptors were investigated. Modulators on purinergic receptors showed only weak and in comparison of the both cell models stongly varying effects on apoA-I specific efflux. So, the inhibiting effects of clopidogrel and suramin could be caused by unspecific effects and not by inhibition of purinergic receptors, due to the fact that also agonists on purinergic receptors revealed partially inhibiting effects on apoA-I specific efflux.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 13:02
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