Untersuchungen zur Struktur, Funktion und Dynamik der Anthranilat-Phosphoribosyltransferase aus Sulfolobus solfataricus

Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Date:	14 May 2007
Referee:	Reinhard (Prof. Dr.) Sterner
Date of exam:	30 May 2006
Institutions:	Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Reinhard Sterner
Keywords:	Extrem thermophile Bakterien , Tryptophanstoffwechsel , Sulfolobus solfataricus , Enzymkinetik , Molekulare Evolution , Domäne <Biochemie> , Enzym , Anthranilat-Phosphoribosyltransferase , Domänenbewegung , Kleinwinkelstreuung , enzyme , Anthranilate-Phosphoribosyltransferase , enzyme kinetics , domain movement , small-angle-x-ray scattering
Dewey Decimal Classification:	500 Science > 570 Life sciences
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	10497

Abstract (German)

Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Zusammenhang zwischen der Struktur, der katalytischen Aktivität und der Dynamik von TrpD am Beispiel des homodimeren Enzyms aus dem hyperthermophilen Achaeon Sulfolobus solfataricus (ssTrpD) untersucht. Zunächst wurde in Kooperation mit Prof. Olga Mayans (Biozentrum der Universität Basel) die Röntgenstruktur des wildtypischen ssTrpD in Anwesenheit der beiden ...

Abstract (German)

Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Zusammenhang zwischen der Struktur, der katalytischen Aktivität und der Dynamik von TrpD am Beispiel des homodimeren Enzyms aus dem hyperthermophilen Achaeon Sulfolobus solfataricus (ssTrpD) untersucht. Zunächst wurde in Kooperation mit Prof. Olga Mayans (Biozentrum der Universität Basel) die Röntgenstruktur des wildtypischen ssTrpD in Anwesenheit der beiden Substrate Anthranilsäure und PRPP gelöst. Es zeigte sich, dass pro Untereinheit im Grenzbereich der kleinen alpha helikalen und der großen alpha/beta Domäne zwei Moleküle Anthranilsäure und ein Molekül PRPP binden. Zusätzlich zu dem ausschliesslich durch die Pyrophosphat- und die Riboseeinheiten von PRPP komplexierten �Standard�-Mg2+-Ion (MG-1) fand sich in der Nähe der 5�-Phosphateinheit von PRPP ein zweites Mg2+-Ion (MG-2), das hauptsächlich von konservierten sauren Seitenketten (Asp223, Glu224) des Proteins gebunden wird.
Um die Bedeutung einzelner Aminsoäuren der beiden Anthranilatbindetaschen I und II und der PRPP Bindetasche für die Substratbindung und die Katalyse zu überprüfen, wurde eine Reihe von Resten mittels gezielter Mutagenese ersetzt, in der Regel durch Alanin, im Fall von Asp223 und Glu224 durch die entsprechenden Amide. Die resultierenden ssTrpD Varianten wurden durch heterologe Genexpression in Escherichia coli hergestellt, gereinigt und durch steady-state enzymkinetische Messungen charakterisiert. Dabei zeigte sich, dass keine der Substitutionen zu einer merklichen Verringerung der Wechselzahl (kcat) führte und damit keiner der ausgetauschten Reste für die Reaktion essentiell ist.
Die Entfernung zwischen den beiden gebundenen Molekülen Anthranilat, AA I und AA II, und dem gebundenen PRPP beträgt in der Röntgenstruktur von ssTrpD 14,6 Å bzw. 8,6 Å, was eine Reaktion unmöglich macht. In Kooperation mit Dr. Dimitri Svergun (EMBL Hamburg) wurden Röntgenkleinwinkelstreuungsmessungen (SAXS) in An- und Abwesenheit der Substrate durchgeführt. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass in ssTrpD durch die Bindung der Substrate eine Relativbewegung der beiden Domänen induziert wird, wodurch AA II und PRPP in einen reaktiven Abstand gebracht werden.
Im letzten Teil der Arbeit wurde eine Variante von ssTrpD mit den Austauschen Asp83Gly und Phe149Ser analysiert, die eine im Vergleich zum wildtypischen Enzym erhöhte katalytische Aktivität aufweist und in früheren Experimenten durch eine Kombination aus Zufallsmutagenese und Selektion in vivo isoliert worden war.

Translation of the abstract (English)

In this work the correlation between the structure, catalytic activity and dynamic of TrpD from the hyperthermophilic archaeon Sulfolobus solfataricus (ssTrpD) was investigated. In cooperation with Prof. Olga Mayans (Biozentrum of the University of Basel) the structure of the wildtype ssTrpD was solved in the presence of both substrates Anthranilate and PRPP. It could be shown that two molecules ...

Translation of the abstract (English)

In this work the correlation between the structure, catalytic activity and dynamic of TrpD from the hyperthermophilic archaeon Sulfolobus solfataricus (ssTrpD) was investigated. In cooperation with Prof. Olga Mayans (Biozentrum of the University of Basel) the structure of the wildtype ssTrpD was solved in the presence of both substrates Anthranilate and PRPP. It could be shown that two molecules Anthranilate and one molecule PRPP are bound between the small alpha-helicale and the larger alpha/beta domain within each subunit. In addition to the standard Mg2+-Ion (MG-1) complexed by the Pyrophosphate- and Ribose unit of PRPP, a second Mg2+-Ion (MG-2) which was complexed by conserved residues (Asp223, Glu224) was found near the 5�-Phosphate unit of PRPP.
To investigate the role of individual amino acids located at the binding pockets of Anthranilate I, II and PRPP for substrate binding and catalysis a number of residues was substituted by site directed mutagenesis, normally by alanine. Asp223 and Glu224 were mutated to the corresponding amides. The resulting ssTrpD variants were heterologously expressed in E. coli, purified and characterised by steady-state enzyme kinetic measurements. It was shown that none of the substitutions led to a significant decrease in the turnover number.
The distance between the two anthranilate molecules and the PRPP bound to ssTrpD is 14.6 and 8.6 Å respectively, which is too far for catalysis. In cooperation with Dr. Dimitri Svergun (EMBL Hamburg) small-angle-X-ray scattering measurements (SAXS) were performed in the presence and absence of the substrates. The results imply that binding of the substrates induces a domain movement to bring the substrates in a reactive proximity.
In addition a variant of ssTrpD with the exchanges Asp83Gly and Phe149Ser, which was isolated by random mutagenesis and in vivo selection and showed an improved catalytic activity compared to the wildtype, was analysed.

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