Ortsgerichtete Rekombination in Chlamydomonas reinhardtii am Beispiel des Cre/lox-Systems

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Mägdefrau, Marion

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Date of publication of this fulltext: 20 Oct 2008 16:17

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Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Date:	19 October 2008
Referee:	Peter (Prof. Dr.) Hegemann
Date of exam:	20 July 2007
Institutions:	Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie
Keywords:	Rekombination , Homologe Rekombination , Heterologe Genexpression , Transformation <Genetik> , Integration <Genetik> , Chlamydomonas reinhardii , ortsgerichtete Rekombination , Cre/lox System , Selektionsmarker , site-specific recombination , Cre/lox system , transformation , heterologous gene expression
Dewey Decimal Classification:	500 Science > 570 Life sciences
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	10687

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Abstract (German)

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Die Grünalge Chlamydomonas reinhardtii hat sich in den vergangenen Jahrzehnten als Modellorganismus für diverse zellbiologische Problemstellungen etabliert. Es wurde eine Vielzahl von Methoden entwickelt, welche die Transformation des Algengenoms erlauben. Wie auch in höheren Pflanzen findet die Integration rekombinanter DNA nichthomolog, d.h. ungerichtet im Genom statt. Dies bedeutet, dass Positionseffekte, Mehrfachinsertionen und daraus resultierende Genstilllegungsmechanismen sowie mögliche Deletionen am Integrationsort die Genexpression des zu untersuchenden Transgens stark beeinflussen können und somit den direkten Vergleich unabhängiger Transformanten schwierig machen. Im Rahmen dieser Arbeit sollte eine Methode etabliert werden, welche die gezielte Veränderung des C. reinhardtii-Genoms mittels ortsgerichteter Rekombination zulässt. Das Cre/lox-Rekombinationssystem, welches aus der Cre-Rekombinase und der loxP-Erkennungssequenz besteht, wird bereits erfolgreich in E. coli, Hefe, Säugerzellen und einigen Pflanzen angewendet.
Für die ortsgerichtete Rekombination in Chlamydomonas wurde zuerst eine Expressionskassette mit einem Reportergen (ble-crluc) zwischen zwei identischen lox-Sequenzen unter der Kontrolle eines Tandem-Promotors und einem zweiten promotorlosen Selektionsmarkergen (aphVIII) in das Genom integriert. Mit Hilfe des entstandenen lox-Rezipienten-Stammes konnte durch die Cre-vermittelte Eliminierung des ble-crluc-Gens und der daraus resultierenden Aktivierung des aphVIII-Gens die Cre-Rekombinaseaktivität im Kerngenom von C. reinhardtii untersucht werden. Es wurden verschiedene Strategien zur Bereitstellung der Cre-Rekombinase im Zellkern von C. reinhardtii untersucht. Sowohl die Einführung eines gereinigten Cre-Enzyms mittels Elektroporation in die Zellen als auch die konstitutive Expression des cre-Gens in den Algen selbst führte nicht zum gewünschten Erfolg. Da ein toxischer Effekt des Enzyms nicht ausgeschlossen werden konnte, wurde eine transiente Expression mit Hilfe der �Cre-Selbsteliminierungs�-Strategie realisiert. Dabei entfernt die Cre-Rekombinase ihre eigene kodierende Sequenz, welche sich ebenfalls zwischen zwei identischen lox-Erkennungssequenzen befindet, und limitiert somit selbst ihre Wirkungszeit auf das Algengenom. Diese Strategie ermöglichte erstmalig die ortsgerichtete Rekombination chromosomaler lox-Sequenzen in C. reinhardtii. Das Cre/lox-System bietet somit zukünftig einen effizienten Weg zur Entfernung von DNA-Sequenzen wie z.B. von Markergenen nach der erfolgreichen Transformation, aber auch eine Möglichkeit zur Integration rekombinanter DNA an spezifischen Stellen im Algengenom.

Translation of the abstract (English)

The green alga Chlamydomonas reinhardtii has been established as a model organism for fundamental biological research during the last decades. Several reliable transformation methods have been developed to manipulate the nuclear genome, but similar to higher plants the integration of DNA occurs predominantly via nonhomologous recombination at apparently random loci. As a consequence the expression of the transgenic constructs is influenced by position effects, multiple copy integration patterns and unpredictable gene silencing mechanisms as well as deletions at the integration locus. This complicates the comparison of independent transformants.
The aim of this work was to establish a method for site-specific recombination to realize the targeted alteration of the C. reinhardtii genome. The Cre/lox system, which consists of the enzyme Cre recombinase and its recognition site loxP, is a widely used tool for the precise manipulation of DNA in E. coli, yeast, mammalian cells and plants. First of all, a test system for monitoring Cre recombinase activity on the nuclear genome of C. reinhardtii was created. It consisted of a first reporter gene (ble-crluc) located between two identical lox sites under control of the constitutive HSP70A/RbcS2 tandem promoter and a second promoterless reporter gene (aphVIII).
The administration of Cre recombinase into the nucleus of C. reinhardtii was carried out by different strategies. The introduction of purified Cre protein by electroporation as well as the constitutive expression of the cre gene failed in C. reinhardtii. Due to a potential toxic effect of Cre in the algal nucleus, a construct for transient cre expression by means of self-excision was created: The recombinase eliminates its own coding sequence, which is also situated between two lox sites, and thus limits its time of activity on the algal genome.
This strategy allowed the site-specific recombination of preexisting chromosomal lox sites in the C. reinhardtii genome for the first time. Therefore the Cre/lox system provides an efficient tool for the genetic manipulation of C. reinhardtii, for example elimination of unneeded DNA sequences (e.g. selectable marker), and a possibility for the targeted integration of transgenes at a specific locus of the C. reinhardtii genome.

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