DNA methylation in chromatin - complexes and mechanisms - University of Regensburg Publication Server

URN to cite this document:: urn:nbn:de:bvb:355-epub-133861
DOI to cite this document:: 10.5283/epub.13386

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Date of publication of this fulltext: 04 Aug 2010 11:12

Details

Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Open Access Type:	Primary Publication
Date:	4 August 2010
Referee:	Prof. Dr. Gernot Längst
Date of exam:	29 July 2009
Institutions:	Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Biochemie III > Prof. Dr. Gernot Längst
Interdisciplinary Subject Network:	Not selected
Keywords:	DNS-Methyltransferase, Chromatin, Nucleosom, Plazenta, HeLa-Zelle, Ubiquitin-Protein-Ligase, Ubiquitin-spezifische-Protease, Dnmt1, Kernextrakt, Dnmt3a, Dnmt3b, DNA methylation, ubiquitin-specific-protease, ubiquitin-ligase, Dnmt1, Dnmt3
Dewey Decimal Classification:	500 Science > 570 Life sciences
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	13386

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Abstract (English)

Abstract (English)

The DNA in the eukaryotic genome is packaged into chromatin whose basic repeating unit is the nucleosome consisting of 147bp of DNA wrapped around an octameric histone core. The histone octamer is composed of two copies of each of the four histone proteins H2A, H2B, H3 and H4.
DNA methylation is an epigenetic mechanism that is involved in various important processes in the cell such as differentiation and proliferation, transcriptional regulation, genomic imprinting, X-chromosome inactivation, silencing of repetitive elements, maintenance of genomic stability and DNA repair. In the mammalian genome, DNA methylation occurs almost exclusively in the context of CpG di-nucleotides and is brought about by three DNA cytosine-5-methyltransferases that use S�adenosyl-methionine (SAM) as methyl-group donor. Due to Dnmt1�s preferential activity towards hemi-methylated DNA and the fact that it restores methylation patterns on the newly synthesized daughter strand during replication, it is referred to as the maintenance DNA methyltransferase, whereas the de novo DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b introduce new methylation marks in the genome. Dnmt3L is structurally related but catalytically inactive and serves as a cofactor for Dnmt3a and Dnmt3b.
Importantly, DNA methylation is indispensible for mammalian embryogenesis and aberrant DNA methylation is often found concomitant with cancer. Dnmt1 was shown to be implicated in the formation of tumors, however the underlying mechanisms especially the question of Dnmt1 targeting remain largely unknown.
The goal of this thesis was to identify new Dnmt1 complexes from native tissues that would allow comparison of complex composition in tumors. ICBP90 (UHRF1) and USP7 were identified as interacting proteins from co-immunoprecipitation experiments. During the course of this study, UHRF1 was described not only to interact with Dnmt1 but to recruit Dnmt1 to replication foci during late S-phase. In vivo and in vitro immunoprecipitations revealed different possible complexes, namely Dnmt1/ICBP90, Dnmt1/USP7 and ICBP90/USP7. Furthermore, a possible trimeric complex of USP7 binding with two different domains to both Dnmt1 and ICBP90 was established. Notably, chromatin immunoprecipitation demonstrated the existence of different Dnmt1/ICBP90/USP7 complexes at four different loci in vivo, however the function in chromatin related processes awaits further investigation.
Interestingly, ICBP90 and USP7 are endowed with antagonistic enzymatic activities. ICBP90 exhibits autoubiquitinylation and ubiquitinylation activity towards histone H3, and USP7 in vitro. On the contrary, USP7 was able to target ICBP90 and histones H2A, H2B and H3 for deubiquitination in vitro whereas global levels of ubiquitinylated H2A and H2B were not changed upon knockdown or over-expression of USP7. Binding of ICBP90 and Dnmt1 to USP7 did not influence the in vitro activity of USP7. Moreover, Dnmt1 was ubiquitinylated by ICBP90 in vitro, but Dnmt1 protein or ubiquitinylation levels were not affected by USP7 over-expression or knockdown in vivo.
Future research will focus on the role of histone ubiquitinylation/deubiquitination in transcriptional repression and silencing of repetitive elements in heterochromatin.
In another project, the properties of Dnmt binding to DNA and mono-nucleosomes and the principle mechanisms of DNA methylation in chromatin by the de novo DNA methyltransferases were in focus. It could be shown that Dnmt3a and Dnmt3b2 stably associated with DNA >35bp in length, albeit longer DNA fragments were preferred indicative of a cooperative binding process. Furthermore, binding to DNA or mono-nucleosomes was highly dynamic and the interaction of mono-nucleosomes with the de novo DNA methyltransferases did not disrupt mono-nucleosomes. Dnmt3a generally bound comparably well to DNA and mono-nucleosomes with different DNA linker length whereas Dnmt3b2 preferentially bound to free DNA and mono-nucleosomes with long linker DNA.
In vitro DNA methylation assays, either performed with radioactive SAM or non-radioactive one, but following single-molecule analysis with bisulfite treatment clearly demonstrated that Dnmt3a and Dnmt3b2 could not methylate DNA within the nucleosome but only linker DNA. This indicated that the DNA strand facing opposite the histone octamer did not represent a target for methylation and that nucleosomes constitute a major restriction for DNA methylation. Further experiments will address the role of chromatin remodeling enzymes in this process.
Dnmt3L, a stimulatory factor for Dnmt3a and Dnmt3b, was shown to bind to non-methylated H3K4. Therefore, the effect of Dnmt3L on binding to DNA and nucleosomes by Dnmt3a and Dnmt3b was analyzed. Dnmt3L itself neither bound to DNA nor to mono-nucleosomes in EMSA experiments. Addition of Dnmt3L to Dnmt3a and Dnmt3b enhanced DNA binding and modified the binding behavior towards nucleosomes.
Interestingly, recombinant Dnmt3L was tightly associated with nucleosomes when purified from Sf21 insect cells. Sucrose density gradient analysis confirmed this observation as Dnmt3L was distributed over the whole gradient with nucleosomal species of different weight. However, when endogenous nucleosomes were substituted for nucleosomal templates of various sizes or �naked� DNA Dnmt3L entered the gradient by 1/3rd, although the peak fractions migrated at higher densities.
To unravel the reasons for the stable association of Dnmt3L with endogenous nucleosomes, future work will concentrate on the identification of possible loading factors, specific posttranslational histone modifications and nucleosomal architecture.

Translation of the abstract (German)

Die DNA des eukaryotischen Genoms liegt in Form von Chromatin vor, dessen wiederholende Grundeinheit das Nukleosom dargestellt. Im Nukleosom ist die DNA (147bp) um ein Oktamer von basischen Proteinen, den vier Histon-Proteinen H2A, H2B, H3 und H4, gewickelt.
Die DNA-Methylierung ist ein epigenetischer Mechanismus, der an verschiedenen, bedeutenden Prozesses in der Zelle, wie der Differenzierung, der Proliferation, der Transkriptionsregulation, dem Phänomen der genomischen Prägung und der X-Chromosom-Inaktivierung, sowie der Aufrechterhaltung der genomischen Integrität, beteiligt ist. In Säugerzellen findet die DNA-Methylierung vorherrschend im Kontext von CpG-Dinukleotiden statt. Die Methylgruppe wird durch die Aktivität von drei verschiedenen DNA-Methyltransferasen vom Methylgruppendonor S�Adenosyl-Methionin auf die C-5 Position des Cytosins übertragen. Aufgrund der bevorzugten Aktivität gegenüber hemi-methylierter DNA und der Komplementierung der DNA-Methlierungs-Muster der neu-synthetisierten Tochterstränge während der DNA-Replikation, wird Dnmt1 häufig als die �Erhaltung-� DNA-Methyltransferase bezeichnet, wohingegen die �de novo� DNA-Methyltransferase Dnmt3a und Dnmt3b neue DNA-Methylierungsmarkierungen im Genom setzen. Dnmt3L ist strukturell ähnlich, jedoch katalytisch inaktiv und dient Dnmt3a und Dnmt3b als Ko-Faktor.
Besonders hervorzuheben ist die Bedeutung der DNA-Methylierung für die Embryonalentwicklung von Säugern. Des Weiteren sind sowohl die de novo als auch die Erhaltungs- DNA-Methylierung gezielte Prozesse, die in der Zelle nicht spontan ablaufen, sondern durch Rekrutierung oder Modulation der Aktivität kontrolliert werden. Die Kenntnisse der zugrunde liegenden Mechanismen bleiben jedoch lückenhaft.
Ziel dieser Arbeit war es, neue Interaktionspartner von Dnmt1 zu finden, um somit ein besseres Verständnis dafür zu bekommen, wie Dnmt1 an die Zielstellen der Methylierung rekrutiert wird.
ICBP90 (UHRF1) und USP7 wurden als Interaktionspartner von Dnmt1 in Kernextrakten aus Hela-Zellen durch Ko-Immunopräzipitationen identifiziert. Während meiner Promotion wurde UHRF1 als ein Faktor beschrieben, der mit Dnmt1 wechselwirkt und Dnmt1 and die Replikationsfoci während der S-Phase rekrutiert. In vivo und in vitro Immunopräzipitationen offenbarten verschiedene mögliche Proteinkomplexe: Dnmt1/ICBP90, Dnmt1/USP7 und ICBP90/USP7. Die erzielten Ergebnisse lassen auch einen möglichen trimeren Komplex zu, in dem USP7 mit zwei unterschiedlichen Domänen mit Dnmt1 und ICBP90 interagiert. Interessanterweise zeigten Chromatin-Immunopräzipitationen die Assoziation unterschiedlicher Proteinkompositionen an vier verschiedenen genomischen Loci in vivo, wobei die Funktion dieser Komplexe weiterer Untersuchungen bedarf.
Interessanterweise sind ICBP90 und USP7 mit gegensätzlichen enzymatischen Aktivitäten ausgestattet. ICBP90 weist in vitro eine Auto-ubiquitinylierungsaktivität und eine Ubiquitinylierungsaktivität gegenüber Histon H3 und USP7 auf. Im Gegensatz dazu entfernte USP7 Ubiquitin-Einheiten von ICBP90 und den Histonen H2A, H2B und H3 in vitro, wohingegen Reduzierung oder Erhöhung der USP7-Proteinmenge in vivo jedoch nicht die Menge an ubiquitinyliertem H2A und H2B veränderte. Die Bindung von ICBP90 und Dnmt1 an USP7 veränderten nicht die in vitro Aktivität von USP7. Darüber hinaus wurde Dnmt1 von ICBP90 in vitro ubiquitinyliert. Die Menge an Dnmt1 oder ubiquitinyliertem Dnmt1 in vivo veränderte sich nicht durch Reduzierung oder Erhöhung der USP7-Proteinmenge.
In einem weiteren Projekt wurden die Bindungseigenschaften gegenüber freier und nukleosomaler DNA durch die de novo DNA-Methyltransferasen Dnmt3a und Dnmt3b sowie des Ko-Faktors Dnmt3L untersucht und die de novo DNA-Methylierung im Nukleosom charakterisiert.
Es konnte gezeigt werden, das Dnmt3a und Dnmt3b2 stabil mit DNA >35bp assoziierte, wobei längere DNA-Fragmente bevorzugt wurden. Letztere Beobachtung lässt auf einen kooperativen Bindungsprozess schließen. Des Weiteren ist die Bindung an freie oder nukleosomale DNA ein dynamischer Vorgang. Die Bindung von Dnmt3a oder Dnmt3b2 an das Nukleosom führt nicht zum Auseinanderfallen des Nukleosoms. Dnmt3a wechselwirkte gleichermaßen gut mit freier DNA und Mono-Nukleosomen mit unterschiedlichen Längen der freien DNA-Überhänge, wohingegen Dnmt3b2 bevorzugt mit freier DNA oder Mono-Nukleosomen mit langen DNA-Überhängen interagierte.
Analyse der in vitro DNA-Methylierung im Nukleosom durch die de novo DNA-Methyltransferasen zeigte deutlich, dass Dnmt3a und Dnmt3b nicht im Nukleosom, sondern lediglich die Eingangs- und Ausgangsstellen des Nukleosoms bzw. vorherrschend die freien DNA-Überhänge methylieren konnten. Die Nuklesom stellt somit eine erhebliche Einschränkung der DNA-Methylierung dar. Zukünftige Experimente werden die Rolle von Chromatin-Umformungsmachinerien in diesem Zusammenhang untersuchen.
Für Dnmt3L, ein Ko-faktor von Dnmt3a und Dnmt3b, wurde gezeigt, dass es an nicht-methlyiertes H3K4 bindet. Daher wurde der Effekt von Dnmt3L auf die Bindung von DNA oder Mono-Nukleosomen durch Dnmt3a und Dnmt3b studiert. Dnmt3L zeigte keinerlei Bindung an DNA oder Nukleosomen in EMSA-Experimenten. Zugabe von Dnmt3L zu Dnmt3a und Dnmt3b erhöhte die Bindung gegenüber freier DNA und veränderte das Bindungsverhalten gegenüber Nukleosomen.
Erstaunlicherweise wurde Dnmt3L assoziiert mit Nukleosomen aus Sf21-Insektenzellen aufgereinigt. Analyse über Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugation bestätigte diese Beobachtung, da Dnmt3L über den gesamten Dichtebereicht mit unterschiedlichen nukleosomalen Spezien verteilt vorlag. Als hingegen endogene Nuklesomen durch entweder freie oder über Salzdialyse assemblierte Nukleosomen ersetzt wurde, wanderte Dnmt3L lediglich bis zu 1/3 in den Gradienten ein, obwohl die Hauptfraktionen bei höherer Dichte anzutreffen waren.
Die Gründe für die stabile Assoziation von Dnmt3L mit endogenen Nukleosomen wird Gegenstand zukünftiger Fragestellungen sein.

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