Considering the significant benefits that site-specific drug therapy offers, in this work, the potential of G-protein-coupled receptors (GPCRs) as candidates for a new class of targets in the field of drug targeting was investigated. In order to evaluate this potential at the cellular level, nanoparticles were conjugated with specific ligands for the human neuropeptide Y (hNPY) Y1 receptor and ...
Abstract (English)
Considering the significant benefits that site-specific drug therapy offers, in this work, the potential of G-protein-coupled receptors (GPCRs) as candidates for a new class of targets in the field of drug targeting was investigated. In order to evaluate this potential at the cellular level, nanoparticles were conjugated with specific ligands for the human neuropeptide Y (hNPY) Y1 receptor and characterized according to their affinity to cells expressing this receptor. A second objective was to explore whether GPCRs provide a portal for nanoparticle delivery into cells, since GPCRs are known to internalize after agonist binding. GPCRs represent the largest class of receptors in the human genome and have, therefore, been a key area of focus in drug research for several decades. Consequently, we know a number of specifically binding ligands as well as the organ distribution of many GPCRs. This makes GPCRs extremely interesting candidates for nanoparticle drug targeting. As model colloid, quantum dots (QDs), semiconductor nanocrystals have been used. Methods for their fabrication were developed and the nanoparticles subsequently were surface-modified by several techniques using poly(ethylene glycol) (PEG) and PEGylated phospholipids. The resulting surface-modified nanocrystals were characterized by dynamic light scattering (DLS), transmission electron microscopy (TEM) and asymmetrical flow field-flow fractionation (AF4) as well as by photometric measurements. Additionally, the particles potential as traceable model nanoparticles for cellular studies was evaluated. For the investigation of targeted uptake of nanoparticles by GPCRs, ligands for the human NPY Y1-receptor were attached to QDs. The particles were tested using Y1-receptor expressing (MCF-7, SK-N-MC) and Y1-receptor lacking (MDA) human cell lines. Confocal laser scanning microscopy revealed specific binding uptake of the particles when they were linked with agonistic peptides for the Y1-receptor. In contrast, when an antagonistic ligand was conjugated with the particles, binding cellular uptake was strongly reduced. Flow-cytometric investigations showed that the ligand-modified QDs strongly and specifically bind to the cells and a multiligand binding of the QDs to the cells was suggested. Finally, the uptake of the agonist-modified QDs was compared with a fluorescent NPY and QDs modified with poly(ethylene imine).
Translation of the abstract (German)
In Anbetracht der signifikanten Vorteile, die eine zielgerichtete Pharmakotherapie bietet, wurde in dieser Arbeit untersucht, welches Potential G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) als neue Klasse von Zielstrukturen im Bereich des Nanopartikel-Targeting aufweisen. Um dies auf zellulärer Ebene zu bestimmen, wurden Nanopartikel mit Liganden spezifisch für den menschlichen Neuropeptid Y (hNPY) ...
Translation of the abstract (German)
In Anbetracht der signifikanten Vorteile, die eine zielgerichtete Pharmakotherapie bietet, wurde in dieser Arbeit untersucht, welches Potential G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) als neue Klasse von Zielstrukturen im Bereich des Nanopartikel-Targeting aufweisen. Um dies auf zellulärer Ebene zu bestimmen, wurden Nanopartikel mit Liganden spezifisch für den menschlichen Neuropeptid Y (hNPY) Y1-Rezeptor verbunden und auf ihre Affinität zu Zellen, die diesen Rezeptor aufweisen, untersucht. Ein weiteres Ziel war festzustellen, ob GPCRs ein geeignetes Eintrittsportal für Nanopartikel in Zellen darstellen, da diese Rezeptoren bekanntermaßen nach Bindung eines Agonisten internalisieren können. GPCRs stellen die größte Klasse von Rezeptoren im menschlichen Genom dar und sind daher seit einigen Jahrzehnten von besonderem Interesse der Arzneistoffforschung. Aus diesem Grunde sind für eine Vielzahl der GPCRs deren Struktur, ihre spezifische Verteilung auf bestimmte Organe, wie auch spezifische Liganden bekannt. Diese Tatsachen machen GPCRs zu vielversprechenden Kandidaten für das Nanopartikel-Targeting. Als Modellpartikel wurden Quantenpunkte (QDs), Halbleiternanokristalle, verwendet. Es wurden Methoden für ihre Herstellung entwickelt und anschließend wurden die Partikel mittels verschiedener Techniken oberflächenmodifiziert, wobei Polyethylenglykole (PEG) und PEGylierte Phospholipide zum Einsatz kamen. Die Partikel wurden mittels dynamischer Lichtstreuung (DLS), Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und asymmetrischer Feldflussfraktionierung (AF4), sowie photometrischen Methoden charakterisiert. Zudem wurde das Potential der Partikel für ihren Einsatz als Marker in zellulären Systemen untersucht. Zur Untersuchung der zielgerichteten Aufnahme von Nanopartikeln über GPCRs, wurden Liganden des NPY Y1-Receptors an Quantenpunkte gebunden. Die Partikel wurden an menschlichen Zelllinien untersucht, die den Rezeptor entweder exprimierten (MCF-7, SK-N-MC) oder den Rezeptor nicht aufwiesen (MDA). Konfokale Fluoreszenzmikroskopie zeigte, dass die Partikel spezifisch über die Rezeptoren an die Zellen binden und, im Falle von agonistischen Liganden, gezielt in die Zellen aufgenommen werden. Im Gegensatz dazu wurde bei der Verwendung antagonistischer Liganden hauptsächlich Bindung ohne anschließende Internalisierung der Partikel in die Zielzelle beobachtet. Durchflusszytometrische Untersuchungen ergaben, dass die Bindung der Ligand-modifizierten Partikel sehr stark und spezifisch ist. Abschließend wurde die Aufnahme der Partikel, die mit Agonisten modifiziert waren, verglichen mit der eines fluoreszenzmarkierten NPY und mit QDs, die Polyethylenimin an der Oberfläche trugen.
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