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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-177743
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 16 November 2010 |
| Referee: | Prof. Dr. Jörg Heilmann and Prof. Dr. Roland Seifert |
| Date of exam: | 29 October 2010 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical Biology (Prof. Heilmann) |
| Interdisciplinary Subject Network: | Not selected |
| Keywords: | cannabinoid receptors, GTPase Assay, fusion proteins, RGS proteins |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 17774 |
Abstract (English)
So far two human cannabinoid receptors (hCBRs) have been identified, both belonging to the family of G protein coupled receptors (GPCRs): the hCB1R mainly located in the brain and the hCB2R predominantly located in the periphery on immune cells. Because of their involvement in many physiological functions, such as movement, metabolic regulation, host defense, analgesia and memory, there is still ...
Abstract (English)
So far two human cannabinoid receptors (hCBRs) have been identified, both belonging to the family of G protein coupled receptors (GPCRs): the hCB1R mainly located in the brain and the hCB2R predominantly located in the periphery on immune cells. Because of their involvement in many physiological functions, such as movement, metabolic regulation, host defense, analgesia and memory, there is still a great interest for targeting CBRs for therapeutic applications.
The aim of this thesis was the establishment of a highly sensitive assay system that is suitable to analyze CBR pharmacology and to screen ligands concerning their CBR activity and their pharmacological profile. Therefore, we established the steady-state [gamma-32P]-GTPase assay, a functional, sensitive and reliable approach to study GPCRs with a read out at a very proximal point of the signal cascade. In native systems, this in-vitro assay showed a very low sensitivity. In rat cerebellum membrane only a weak stimulation of GTPase activity was measurable. The use of membranes of CBR transfected HEK 293 cells did not lead to a successful outcome as no change of GTPase activity caused by a ligand was detectable. These results directed us to employ Spodoptera frugiperda (Sf9) cell membranes as expression system. Here, the co-expression of CBRs, Gα subunit and the G beta-gamma heterodimer greatly improved the sensitivity of the assay.
As the efficacy of receptor-G protein interaction is highly influenced by the expression levels and density of these proteins in the membrane, we examined the impact of CBR-Gα fusion proteins on pharmacological properties of known CBR ligands. With the defined 1:1 stoichiometry and the forced anchor of the signaling partners in the membrane, the sensitivity of the GTPase assay was dramatically increased. Influences of regulators of G protein signaling (RGS) proteins RGS4 and RGS19 on GTPase activity in the co-expression and fusion system were examined. The results revealed that RGS4 in contrast to RGS19 behaves as a GTPase activating protein (GAP) for CBRs.
Comparing pharmacological properties of known CBR ligands evaluated in the co-expression and fusion systems in the absence or presence of RGS4 and RGS19, altered potencies and efficacies became apparent, especially in the CB2R test systems. These data suggests that ligands stabilized specific GDP/GTP exchange-promoting receptor conformations that are influenced by the forced contact to the Gαi2 subunit and the addition of RGS protein. This phenomenon is indicative for the concept of ligand-specific receptor conformation.
For ligand screening procedures and to evaluate pharmacological parameters of new CBRs ligands, we used Sf9 cell membranes expressing CBR-Gα fusion proteins, the G beta-gamma-heterodimer and RGS4 as this constellation offers the highest sensitivity among the tested protein combinations. We examined various alkamides, polyacetylenes and polyenes isolated from Echinacea species as well as synthesized indole derivatives. From the natural compounds several alkamides showed measurable activity in a CB2R selective manner. In contrast to the alkamides, polyacetylenes and polyenes did not show any effect, suggesting that they do not exert their immunomodulatory effect via the CBRs. Furthermore, new
2,3-disubstituted indole derivatives with activity at the CB2R were found. Thereby, the 3-(2-butylindole-3-yl)prop-2-en acid ethyl ester showed the strongest effect and provides a promising basis for the development of potent and selective CB2R ligands.
Translation of the abstract (German)
Die beiden bisher identifizierten humanen Cannabinoidrezeptoren (hCBRs) gehören zur Familie der G Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCRs): der hCB1R ist überwiegend im Gehirn lokalisiert und der hCB2R wird hauptsächlich in der Peripherie auf Immunzellen exprimiert. Die Beteiligung an vielen physiologischen Funktionen, wie Koordination von Bewegungsabläufen, Regulation des Energiemetabolismus und ...
Translation of the abstract (German)
Die beiden bisher identifizierten humanen Cannabinoidrezeptoren (hCBRs) gehören zur Familie der G Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCRs): der hCB1R ist überwiegend im Gehirn lokalisiert und der hCB2R wird hauptsächlich in der Peripherie auf Immunzellen exprimiert. Die Beteiligung an vielen physiologischen Funktionen, wie Koordination von Bewegungsabläufen, Regulation des Energiemetabolismus und Einbindung in Abwehrmechanismen, Analgesie und Gedächtnisfunktionen machen die hCBRs zu interessanten therapeutischen Zielstrukturen.
Das Ziel dieser Doktorarbeit war die Etablierung eines hochsensitiven Testsystems, das sowohl zur Analyse der CBR-Pharmakologie als auch zum Screening neuer Liganden und zur Charakterisierung deren pharmakologischen Eigenschaften geeignet ist. Hierfür wurde der steady-state [gamma-32P]-GTPase Assay etabliert, der als funktionelle, sensitive und erprobte Methode mit einer Effektmessung an einem proximalen Punkt der Signalkaskade bekannt ist. In nativen Systemen zeigte dieser in-vitro Test eine geringe Sensitivität. In Ratten-Kleinhirnmembran konnte nur eine schwache Stimulation der GTPase Aktivität gemessen werden. In Membranen transfizierter HEK 293 Zellen war keine GTPase Aktivität messbar. Aufgrund dieser Ergebnisse wurden Spodoptera frugiperda (Sf9) Zellen als Expressionssystem verwendet, da in diesen Zellen die Sensitivität des Assays durch co-Expression von CBRs, der Gα Untereinheit und des G beta-gamma Heterodimers deutlich erhöht wurde.
Da die Interaktion von Rezeptor und G Protein stark von deren Expressionslevel und der Dichte beider Proteine in der Membran abhängig ist, wurde untersucht, welchen Einfluss eine Fusion des Rezeptors mit der Gα Untereinheit auf die pharmakologischen Eigenschaften bereits bekannter CBR Liganden ausübt. Die definierte 1:1 Stöchiometrie und die feste Verankerung der Signalpartner in der Zellmembran erhöhte die Sensitivität des Testsystems deutlich. Zusätzlich wurden die Einflüsse der RGS (Regulatoren des G Protein Signals) Proteine RGS4 und RGS19 untersucht. Hierbei ergab sich, dass sich RGS4 im Gegensatz zu RGS19 als GTPase aktivierendes Protein (GAP) an CBRs verhält.
Beim Vergleich der pharmakologischen Eigenschaften bekannter CBR-Liganden, die im co-Expressions- und Fusionssystem in Abwesenheit oder Anwesenheit von RGS4 und RGS19 erhoben wurden, zeigte sich – vor allem in den CB2R Systemen – eine Abweichung in den EC50-Werten und in der maximalen Stimulation. Diese Diskrepanz deutet darauf hin, dass die Liganden, abhängig von der Fusion und den zugesetzten RGS-Proteinen, spezifische Rezeptorkonformationen stabilisieren, die den Austausch GDP/GTP begünstigen. Dieses Phänomen lässt sich gut mit dem Konzept der Ligand-spezifischen Rezeptorkonformation erklären.
Für Untersuchung potentieller CBR-Liganden und zur Beurteilung der pharmakologischen Parameter wurden Sf9 Zellmembranen verwendet, die CBR-Gα Fusionsproteine, das G beta-gamma Heterodimer und RGS4 exprimieren. Diese Konstellation erwies sich als die Sensitivste der getesteten Proteinkombinationen. Neben verschiedenen Alkamiden, Polyacetylenen und Polyenen - isoliert aus Echinacea Spezies - wurden auch synthetische Indol-Derivate auf ihre Aktivität an den CBRs untersucht. Von den natürlichen Substanzen zeigten einige Alkamide selektive CB2R Aktivität. Im Gegensatz dazu übten die Polyacetlyene und Polyene keinen Einfluss auf die GTPase Aktivität der CBRs aus, was die Vermutung nahelegt, dass die immunmodulatorischen Effekte dieser Substanzen nicht über die CBRs vermittelt werden. Des Weiteren fanden wir 2,3-substituierte Indol-Derivate mit Aktivität am CB2R. Von diesen zeigte der 3-(2-Butylindol-3-yl)prop-2-ensäureethylester die stärkste Affinität und bietet somit eine vielversprechende Grundlage für die Entwicklung potenter CB2R selektiver Liganden.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 15:19
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