| License: Publishing license for publications including print on demand (5MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-225035
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.22503
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 6 December 2011 |
| Referee: | Prof. Dr. Armin Buschauer and Prof. Dr. Joachim Wegener and Prof. Dr. Sigurd Elz |
| Date of exam: | 28 October 2011 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical/Medicinal Chemistry II (Prof. Buschauer) |
| Keywords: | NPY, Y2 receptor antagonists, pharmacological tools, confocal miroscopy, flow cytometry, radioligand, fluorescence ligand |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 22503 |
Abstract (English)
Neuropeptide Y (NPY), a 36 amino acid peptide, is widely distributed in the central and peripheral nervous system, where it acts as a neurotransmitter and exhibits a large number of physiological functions, including the regulation of blood pressure, control of food intake, anxiety, pain and hormone secretion. In humans, these effects are mediated by four receptor subtypes (Y1, Y2, Y4, Y5), all ...
Abstract (English)
Neuropeptide Y (NPY), a 36 amino acid peptide, is widely distributed in the central and peripheral nervous system, where it acts as a neurotransmitter and exhibits a large number of physiological functions, including the regulation of blood pressure, control of food intake, anxiety, pain and hormone secretion. In humans, these effects are mediated by four receptor subtypes (Y1, Y2, Y4, Y5), all belonging to class A of the superfamily of G-protein coupled receptors (GPCRs). The Y2R is expressed, e. g., in sympathetic nerve endings, in the renal tubules and in distinct brain regions such as the hippocampus and the hypothalamus. It is discussed to be involved in several human diseases, for instance, epilepsy, obesity and cancer, and therefore regarded as an attractive target in drug design. However, antagonistic pharmacological tools for the elucidation of the receptor´s function in health and disease are still missing.
In 1999, the (S)-argininamide BIIE 0246, a C-terminal mimic of NPY, was reported the first highly potent and selective Y2R antagonist. NG-Acylation of BIIE 0246 was demonstrated to retain or even increase the Y2R affinity, thereby improving the pharmacokinetic properties. Thus, we prepared Nω-aminoacylated analogs as precursors towards radio- and fluorescence labeled as well as bivalent pharmacological tools according to the guanidine-acylguanidine bioisosteric approach. Such derivatives, bearing a free amino group, exhibited the highest Y2R affinities (Ki < 10 nM). Interestingly, masking the positive charge, e.g. by acylation, resulted in decreased affinities, presumably, due to the loss of an additional electrostatic interaction of the primary amine with the receptor.
Bivalent ligands were synthesized starting from various amine precursors derived from BIIE 0246 by acylation with different aliphatic dicarboxylic acids. Only minor differences in affinities (Ki = 61-300 nM) were observed for the majority of the compounds, irrespective of the diversity in length and chemical nature of the spacer. However, bivalent ligand 4.6, constructed from an amine precursor bearing an additional amino group in the linker, showed a binding affinity (Ki = 21 nM) and antagonistic activity (KB = 15 nM) in the same range as the monovalent antagonists, corroborating the affinity-enhancing effect of a positive charge in the linker.
Fluorescence ligands were synthesized from the amine precursors by acylation with succinimidyl esters or by ring transformation of pyrylium dyes. In terms of retaining affinity, the pyrylium dyes were superior to the bulky cyanine, hemicyanine and Bodipy dyes. Whereas the majority of the cyanine and hemicyanine labeled fluorescent ligands proved to be suitable for the detection of Y2Rs at the cell membrane by confocal microscopy, rapid cellular uptake was observed for most of the Py-1 and Py-5 coupled antagonists. Based on the results from binding studies and confocal microscopy, four fluorescent Y2R antagonists (5.4, 5.15-5.17) were chosen for flow cytometric binding studies. These compounds turned out to be applicable as labeled standard ligands in saturation and competition binding experiments. Interestingly, kinetic studies revealed a pseudo-irreversible binding of 5.16 at the Y2R. The endogenous ligand NPY was not able to displace the novel red-fluorescent Y2R antagonists 5.4 and 5.16 even at very high concentrations.
Acylation of the amine precursor (S)-3.48 with succinimidyl [2,3-3H]-propionate afforded the easily accessible, highly potent and selective tritiated Y2R antagonist [3H]-UR-PLN196 (A2: 43 nM, Ca2+ assay; KD: 43 nM, determined by kinetic studies), which was shown to be useful for the quantification of Y2R binding sites and for the radiochemical determination of Y2R binding affinities of small molecules. In addition, the novel radioligand was identified as an insurmountable antagonist against pNPY exhibiting pseudo-irreversible binding at the Y2R similar to the fluorescent labeled antagonist 5.16.
In conclusion, this work presents a straight-forward synthetic route towards labeled argininamide-type Y2R antagonists related to BIIE 0246 with improved physicochemical properties. These compounds are useful pharmacological tools for the detection of the Y2R in vitro and for detailed investigations of the antagonistic binding mode, respectively, as well as for the identification and characterization of small molecule Y2R antagonists. Moreover, these tracers are suitable to replace labeled NPY standard ligands in binding assays due to their beneficial properties in terms of Y2 receptor subtype selectivity, antagonistic mode of action, stability and kinetics.
Translation of the abstract (German)
Neuropeptid Y (NPY) ist eines der häufigsten Neuropeptide im menschlichen Gehirn und fungiert als Neurotransmitter im zentralen und peripheren Nervensystem. Es ist an einer Vielzahl von physiologischen Prozessen beteiligt, wie z.B. der Regulation des Blutdrucks, der Sekretion zahlreicher Hormone, der Kontrolle der Nahrungsaufnahme, Anxiolyse und Schmerz. Der Y2 Rezeptor (Y2R) wird in Nervenenden, ...
Translation of the abstract (German)
Neuropeptid Y (NPY) ist eines der häufigsten Neuropeptide im menschlichen Gehirn und fungiert als Neurotransmitter im zentralen und peripheren Nervensystem. Es ist an einer Vielzahl von physiologischen Prozessen beteiligt, wie z.B. der Regulation des Blutdrucks, der Sekretion zahlreicher Hormone, der Kontrolle der Nahrungsaufnahme, Anxiolyse und Schmerz. Der Y2 Rezeptor (Y2R) wird in Nervenenden, dem proximalen Tubulus sowie bestimmten Hirnregionen, wie dem Hippocampus oder dem Hypothalamus, exprimiert. Er ist an mehreren Krankheitsbildern beteiligt, z.B. Epilepsie, Fettleibigkeit und Krebs, und wird daher als ein vielversprechendes Target für die zukünftige Wirkstoffentwicklung angesehen. Jedoch fehlen bis heute hochpotente und selektive Antagonisten, welche als pharmakologische Werkzeuge die Funktion des Rezeptors in den Krankheitsbildern entschlüsseln.
Das (S)-Argininamid BIIE 0246 wurde 1999 als erster hochpotenter und selektiver Y2R Antagonist beschrieben. Nω-Acylierung resultierte in gleichbleibender oder sogar erhöhter Bindungsaffinität, wodurch die pharmakokinetischen Eigenschaften verbessert wurden. Daher wurden im Rahmen dieses Projektes Nω-aminoacylierte Analoga als „Precursor“ für radio- und fluoreszenzmarkierte als auch bivalente pharmakologische Werkzeuge mittels Guanidin-Acylguanidin bioisosterem Austausch dargestellt. Diese – bei physiologischem pH positiv geladenen – Derivate wiesen die höchste Affinität am Y2R auf (Ki < 10 nM). Interessanterweise führte die Maskierung der positiven Ladung durch Acylierung zu einer verringerten Affinität, höchstwahrscheinlich in Folge des Verlusts einer zusätzlichen elektrostatischen Wechselwirkung des primären Amins mit dem Rezeptor.
Eine kleine Reihe bivalenter Liganden wurde ausgehend von diversen Aminpräkursoren synthetisiert mittels Acylierung mit verschiedenen aliphatischen Dicarbonsäuren und verzweigten Linkern, welche eine terminale Aminogruppe beinhalten. Für die Mehrheit der Verbindungen wurden nur geringe Unterschiede in der Affinität (Ki = 61-300 nM) beobachtet, ungeachtet der unterschiedlichen Länge sowie chemischen Struktur der eingesetzten Spacer. Der Ligand, welcher eine zusätzliche positive Ladung in jeder Linkergruppe des Aminpräkursors aufweist, zeigte eine Bindungsaffinität (Ki = 21 nM) und eine Aktivität (KB = 15 nM) im Bereich der monovalenten Antagonisten. Diese Beobachtung betont nochmals den affinitätssteigernden Effekt einer positiven Ladung im Linker.
Die Verknüpfung der Fluorophore mit den Aminvorstufen erfolgte entweder durch Acylierung mit Aktivestern oder durch Ringtransformation von Pyryliumfarbstoffen. Die Pyryliumfarbstoffe waren den sperrigen Cyaninen, Hemicyaninen und Bodipy Farbstoffen welche mittels Acylierung eingeführt werden bezüglich des Erhalts der Bindungsaffinität überlegen. Nichtsdestotrotz wurde die Mehrheit der cyanin- und hemicyaninmarkierten Fluoreszenzliganden erfolgreich am Konfokalmikroskop untersucht, wohingegen für die meisten Py-1 und Py-5 markierten Antagonisten eine schnelle Diffusion in die Zellen beobachtet wurde. Basierend auf den Ergebnissen der Bindungs- und Konfokalmikroskopiestudien wurden vier Fluoreszenzliganden für weitere durchflusszytometrische Bindungsuntersuchungen ausgewählt. Ihre Anwendbarkeit als Standardliganden wurde mittels Sättigungs- und Verdrängungsversuchen bewiesen. Letztlich wurde in Kinetikstudien des Fluoreszenzliganden UR-PLN191 eine pseudo-irreversible Bindung am Y2R beobachtet. Darüber hinaus war NPY als endogener Ligand sogar in hohen Konzentrationen nicht in der Lage die neuen Fluoreszenzliganden UR-PLN179 und UR-PLN191 zu verdrängen.
Acylierung der Aminvorstufe UR-PLN26 mit NHS-[2,3-3H]-propionat brachte den hochpotenten und selektiven tritiierten Y2R Antagonisten [3H]-UR-PLN196 hervor (A2: 43 nM, Ca2+-Assay; KD: 43 nM, Kinetik). Dieser erwies sich als nützlich für die Quantifizierung von Y2R Bindungsstellen und für die radiochemische Bestimmung der Y2R Bindungsaffinität von niedermolekularen Verbindungen. Des Weiteren wurde der neuartige Radioligand als unüberwindbarer Antagonist versus pNPY identifiziert. Ähnlich der Bindungseigenschaften des Fluoreszenzliganden UR-PLN191 wies der tritiierte Antagonist eine pseudo-irreversible Bindung am Y2R auf.
Die beschriebenen Verbindungen können als wertvolle pharmakologische Werkzeuge für in vitro Untersuchungen des Y2Rs angesehen werden.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 05:49
Owner only: item control page
Download Statistics