| License: Publishing license for publications including print on demand (7MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-230602
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.23060
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Number of Pages: | 154 |
| Date: | 22 January 2013 |
| Referee: | Prof. Dr. Reinhard Sterner and PD Dr. Winfried Hausner and Prof. Dr. Herbert Tschochner |
| Date of exam: | 20 December 2011 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Reinhard Sterner |
| Interdisciplinary Subject Network: | Not selected |
| Keywords: | Funktionsaufklärung, Nukleinsäurebindende Proteine, DNA Reparatur, SOS-Antwort, functional assignment, nucleic acids binding, DNA repair, SOS-response |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 23060 |
Abstract (German)
Die funktionelle Charakterisierung von unbekannten Proteinen ist eine der wichtigsten Aufgaben des Post-Genom-Zeitalters. Auch wenn bereits erfolgversprechende computergestützte Verfahren zur Funktionszuweisung entwickelt wurden, sind biochemische und molekulargenetische Analysen weiterhin unumgänglich, um die physiologische Aufgabe solcher Proteine zweifelsfrei zu bestimmen. Die funktionelle ...
Abstract (German)
Die funktionelle Charakterisierung von unbekannten Proteinen ist eine der wichtigsten Aufgaben des Post-Genom-Zeitalters. Auch wenn bereits erfolgversprechende computergestützte Verfahren zur Funktionszuweisung entwickelt wurden, sind biochemische und molekulargenetische Analysen weiterhin unumgänglich, um die physiologische Aufgabe solcher Proteine zweifelsfrei zu bestimmen. Die funktionelle Annotation kann dabei durch die Einbeziehung von Vorinformationen wesentlich vereinfacht werden. So kann man sich beispielsweise zunutze machen, dass sich neue Proteinfunktionen oft durch Genduplikation und anschließende Diversifikation, ausgehend von einem gemeinsamen Vorläufer, entwickelt haben. Von einem bereits gut charakterisierten homologen Protein kann also auf eine mögliche Funktion des Untersuchungsobjekts geschlossen werden.
Ein Beispiel für solche Proteine unbekannter Funktion ist die TrpD2-Familie. Diese Proteine sind nahe verwandt zur Anthranilat-Phosphoribosyltransferase (TrpD), einem homodimeren Enzym der Tryptophan-Biosynthese. Eine entferntere Verwandtschaft besteht außerdem zu den Nukleosid-Phosphorylasen der Klasse II (NP-II), die eine wichtige Rolle im Nukleotid-salvage-pathway spielen. Bisher sind etwa 140 Vertreter der TrpD2-Proteine bekannt, die ausschließlich in Bakterien zu finden sind. Sie zeigen im Durchschnitt etwa 17 % Sequenzidentität zu TrpD und 10 % Sequenzidentität zu NP-II Enzymen, können aber deren Reaktionen nicht katalysieren.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Funktion der TrpD2-Proteinfamilie mit Methoden der Bioinformatik, Strukturbiologie, Biochemie, Mikrobiologie und Genetik analysiert. Wegen der einfachen Handhabung und der genetischen Zugänglichkeit wurden die meisten Untersuchungen am TrpD2-Protein aus E. coli, YbiB, durchgeführt. Zunächst wurde dessen Röntgenstruktur in Kooperation mit Prof. Olga Mayans gelöst. Dabei zeigte das Protein eine hohe strukturelle Ähnlichkeit zu TrpD und ebenso eine homodimere Quartärstruktur. Allerdings enthält YbiB zusätzlich eine positiv geladene Oberflächenfalte, die in der TrpD-Struktur fehlt. Die Lysin- und Argininresiduen in dieser Falte sind in der gesamten TrpD2-Proteinfamilie strikt konserviert. Aus der Form dieser Vertiefung und der Anordnung der positiven Ladungen wurde geschlossen und später experimentell bestätigt, dass Nukleinsäuren von YbiB gebunden werden können. Direkt an diese Nukleinsäurebindestelle grenzt eine Grube mit dem postulierten aktiven Zentrum an, in der sich gehäuft weitere vollständig konservierte Residuen befinden. Die genaue strukturelle Kenntnis des YbiB-Nukleinsäure-Komplexes könnte die Funktionsaufklärung von YbiB maßgeblich unterstützen. Nachdem alle konventionellen Ansätze zur Cokristallisation fehlgeschlagen waren, wurde eine Methode zur kovalenten Fixierung und Reinigung des Komplexes durch Einsatz von nichtnatürlichen Aminosäuren entwickelt. Darauf aufbauend können nun neue Kristallisationsansätze mit höherer Erfolgswahrscheinlichkeit durchgeführt werden.
Die Bindung von einzelsträngigen Oligonukleotiden an YbiB und das TrpD2-Protein aus Aquifex aeolicus wurde mittels electro mobility shift assays (EMSAs), Fluoreszenzspektroskopie, Fluoreszenzpolarisation und Oberflächenplasmonresonanz (SPR) unabhängig voneinander bestätigt und quantifiziert. Für die Bindung von einzelsträngigen DNA-Fragmenten an YbiB ergaben sich KD-Werte zwischen 6 und 60 nM, ohne erkennbare Sequenzspezifität. Einzelsträngige RNA wird vom Protein gleichermaßen gut gebunden, dagegen ist die Affinität für doppelsträngige DNA um ca. zwei Größenordnungen verringert. Durch SELEX konnten Aptamere isoliert werden, die eine erhöhte Affinität zu YbiB zeigen. Ihre derzeit laufende Charakterisierung wird zeigen, ob die gefundenen Sequenzmotive tatsächlich eine funktionelle Relevanz haben.
Das ybiB-Gen ist, wie alle trpD2-Gene, außerhalb des Tryptophan-Operons zu finden und bildet in E. coli ein LexA-kontrolliertes Operon mit der DNA-Helikase dinG. Dies, wie auch vergleichende Proteomanalysen in E. coli, deutet auf eine Beteiligung des Proteins an der SOS-Antwort und somit der Reaktion auf DNA-schädigende Bedingungen hin. Die gezielte Expression von ybiB in einem SOS-Antwort-defizienten E. coli-Stamm führte spezifisch zu einer gesteigerten Resistenz der Zellen gegenüber dem zytotoxischen und mutagenen Agens Mitomycin C, nicht aber gegenüber anderen mutagenen Stoffen. Bei YbiB und der gesamten TrpD2-Proteingruppe handelt es sich also wahrscheinlich um eine neue Klasse von Reparaturenzymen, deren Mitglieder Mitomycin-C-typische Schäden, wie z. B. Strang-Quervernetzungen erkennt. Die evolutionäre Verwandtschaft mit den Nukleosid-Phosphorylasen lässt vermuten, dass die TrpD2-Enzyme quervernetzte Basen phosphorolytisch aus dem Genom entfernen könnten. Diese Hypothese soll nun durch in-vitro-Experimente mit Mitomycin C-geschädigten Nukleinsäuren überprüft werden.
Translation of the abstract (English)
Determining the functions of uncharacterized proteins is one of the most challenging tasks of the post genomic era. Today, the TrEMBL database contains over 16 million entries and their number is still growing almost exponentially. Conservative estimations assume that at least one third of these sequences have unknown, uncertain or incorrectly annotated functions. This fact emphasizes the ...
Translation of the abstract (English)
Determining the functions of uncharacterized proteins is one of the most challenging tasks of the post genomic era. Today, the TrEMBL database contains over 16 million entries and their number is still growing almost exponentially. Conservative estimations assume that at least one third of these sequences have unknown, uncertain or incorrectly annotated functions. This fact emphasizes the importance of functional analysis to enhance our knowledge of the protein function space. Although promising computational approaches for functional assignment have already been developed, biochemical analyses are still indispensable to definitely determine the physiological role of such proteins. Functional annotation can greatly be facilitated by including initial knowledge, such as an evolutionary relationship of unknown proteins with well characterized homologous enzymes. Those protein pairs have presumably evolved from a common ancestor by gene duplication and diversification.
One example for such proteins with unknown function is the TrpD2 family. These proteins are closely related to the anthranilate phosphoribosyltransferase (TrpD), a homodimeric enzyme involved in tryptophan biosynthesis. Additionally, TrpD2 shows a more divergent relationship to the nucleoside phosphorylases class II (NP-II) that have a role in the nucleotide salvage pathway. The TrpD2 group consists of about 140 proteins that occur widespread among Bacteria, but not in Archaea. They share on average 17 percent sequence identity with TrpD and about 10 percent with NP-II proteins, but catalyze neither the TrpD nor the NP-II reaction.
Within this work the function of the TrpD2 protein family was analyzed with methods of computational biology, structural biology, biochemistry, microbiology and genetics. Most experiments were carried out with the TrpD2 protein from E. coli, YbiB. As a first step the crystal structure of YbiB was solved in collaboration with the group of Olga Mayans. It is overall very similar to the structure of TrpD (r.m.s.d. = 2.4 Å for 289 superimposed Cα atoms) but exhibits a positively charged surface groove which is missing in TrpD. The arginine and lysine residues in this groove are conserved throughout the whole TrpD2 group. The shape of the groove and the charge distribution suggested that YbiB might bind nucleic acids which was verified later experimentally. Adjacent to this surface groove the putative active site is located within a cavity, where strictly conserved residues are accumulated. To support the functional assignment structural information about the YbiB-nucleic acid-complex should be obtained. Because all conventional approaches for co-crystallization had failed a method for a covalent fixation and purification of this complex was developed by using non-natural amino acids. Constitutive crystallization screens with higher chances of success will be carried out in the near future.
Binding of single stranded nucleic acids to YbiB and the TrpD2 protein from Aquifex aeolicus could be detected and quantified by electro mobility shift assays, fluorescence spectroscopy, fluorescence polarization, and surface plasmon resonance. For single stranded DNA a non-sequence specific interaction with KD values ranging from 6 to 60 nM was found. Single stranded RNA is bound equally well, whereas the affinity for double stranded DNA is decreased by two orders of magnitude. By SELEX, aptamers with an increased affinity for YbiB could be identified. Their further characterization is currently carried out and will show if the isolated sequence motives are functionally relevant.
The ybiB gene is, like all TrpD2 genes, located outside the tryptophan operon. It forms a LexA controlled operon together with a DNA helicase. In accordance with comparative proteomic data this finding points to a possible involvement in the E. coli SOS response to DNA-damaging conditions. In support of this hypothesis, it was shown that within an SOS-deficient E. coli strain YbiB confers an enhanced resistance against the mutagenic substance Mitomycin C but not against other mutagens tested in vivo. These data suggest that the TrpD2 proteins represent a novel class of DNA-repair enzymes whose members recognize Mitomycin C-induced DNA-damages, for example interstrand crosslinks. The excision of damaged bases could be accomplished via phosphorylysis, since TrpD2 enzymes are evolutionary linked to the class II nucleoside phosphorylases. This hypothesis will be further tested by in vitro experiments with Mitomycin C damaged nucleic acids
Metadata last modified: 26 Nov 2020 05:23
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